背景[1-3]
植物L苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中浓度，或者与CUTOFF值相比较，从而判定标本阴阳性。
植物L苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒
标本要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
操作步骤：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
试剂盒性能
1.检测范围：1.25 U/L–40 U/L。
2.灵敏度：最低检测浓度小于0.1 U/L。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。
应用[4][5]
用于茶树两个响应低温与干旱胁迫的苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达与功能分析研究
基于茶树基因组研究结果,克隆获得了南川大树茶苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase,PAL）家族基因成员CsPAL-a和CsPAL-d的cDNA和启动子序列,推导了其编码的氨基酸序列,并对其进行了生物信息学分析。对南川大树茶两年生植株进行4℃低温和PEG6000模拟干旱处理,通过测定遭受胁迫后的茶树叶片内可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、相对电导率和抗氧化酶活性,分析了以上两种胁迫对南川大树茶和CsPAL-a、CsPAL-d的表达模式的影响。利用实时荧光定量和组织化学染色法分析了CsPAL-a和CsPAL-d的组织特异性表达。借助在模式植物拟南芥中过表达验证了CsPAL-a和CsPAL-d的功能。
主要结果如下:1、茶树CsPAL-a和CsPAL-d基因的克隆和序列分析从南川大树茶中克隆获得两个PAL基因,分别为CsPAL-a和CsPAL-d。其中CsPAL-a的ORF框长2121 bp,编码706个氨基酸残基,推测分子量77.08 kD,等电点6.26。CsPAL-d的ORF框长2145 bp,编码714个氨基酸残基,推测分子量77.73 kD,等电点6.12。序列分析显示CsPAL-a和CsPAL-d均为亲水性蛋白,不含有跨膜结构域,均具有苯丙氨酸解氨酶的保守结构域,在系统进化关系上与葡萄的亲缘关系较近。
2、CsPAL-a和CsPAL-d响应低温和干旱胁迫qPCR检测结果表明,在正常生长条件下,南川大树茶叶片中CsPAL-a的表达量约为CsPAL-d的7倍,当人为对南川大树茶进行低温和干旱处理后,发现CsPAL-a和CsPAL-d的表达水平均显著提高,CsPAL-a表达上调约3倍,CsPAL-d表达上调高达10倍。这表明CsPAL-a和CsPAL-d在南川大树茶抵抗低温和干旱胁迫方面发挥着积极作用。
3、CsPAL-a和CsPAL-d基因在南川大树茶中的表达模式qPCR检测结果表明,CsPAL-a在茶树各个组织部位均有表达,茎中相对表达量最高,其次分别是嫩芽和叶,成熟叶中最低;CsPAL-d在成熟叶（第四叶）表达量最高,其次是嫩芽和叶。表明CsPAL-a和CsPAL-d在南川大树茶中具有不同的表达模式。
4、CsPAL-a和CsPAL-d基因的表达水平抗寒抗旱能力对过表达拟南芥材料进行（Abscisic acid,ABA）、JA茉莉酸（Jasmonic acid,JA）敏感性分析。结果表明,相对于野生型,转基因拟南芥种子的萌发率降低;对两种转基因拟南芥材料进行不同程度（4℃和-20℃）低温处理和人工模拟干旱处理,结果显示转基因拟南芥具有更强的耐寒、耐旱能力。
5、CsPAL-a和CsPAL-d启动子的克隆和功能分析对启动子功能的研究可以明确基因的表达特征和调控机制,有助于对基因功能的分析。
参考文献
[1]Identification of novel cis‐elements bound by BplMYB46 involved in abiotic stress responses and secondary wall deposition[J].Huiyan Guo,Liuqiang Wang,Chuanping Yang,Yiming Zhang,Chunrui Zhang,Chao Wang.Journal of Integrative Plant Biology.2018(10)
[2]Transcriptome sequencing dissection of the mechanisms underlying differential cold sensitivity in young and mature leaves of the tea plant（Camellia sinensis）[J].Na-na Li,Chuan Yue,Hong-li Cao,Wen-jun Qian,Xin-yuan Hao,Yu-chun Wang,Lu Wang,Chang-qing Ding,Xin-chao Wang,Ya-jun Yang.Journal of Plant Physiology.2018
[3]A comparison of the molecular mechanisms underpinning high-intensity,pulsed polychromatic light and low-intensity UV-C hormesis in tomato fruit[J].G.Scott,M.Dickinson,G.Shama,M.Rupar.Postharvest Biology and Technology.2018
[4]Six phenylalanine ammonia-lyases from Camellia sinensis:Evolution,expression,and kinetics[J].Yingling Wu,Wenzhao Wang,Yanzhi Li,Xinlong Dai,Guoliang Ma,Dawei Xing,Mengqing Zhu,Liping Gao,Tao Xia.Plant Physiology and Biochemistry.2017
[5]仪丹.茶树两个响应低温与干旱胁迫的苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达与功能分析[D].西南大学,2020.