背景[1-3]
人肽聚糖(PG)ELISA试剂盒用于测定血清，血浆及相关液体样本中肽聚糖(PG)相关含量或活性。
原理：试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被肽聚糖(PG)捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的肽聚糖(PG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人肽聚糖(PG)ELISA试剂盒
样本要求：
1）血清
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
（2）血浆：
应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
（3）尿液：
用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
（4）细胞培养上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
操作步骤:
1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
4.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于脂多糖/肽聚糖诱导人血小板凋亡的体外研究
通过制备人的洗涤血小板,并在TLR4/TLR2单克隆抗体阻断前后分别给予LPS/PGN刺激,初步探讨体外条件下LPS/PGN对血小板凋亡的诱导效应及LPS-TLR4、PGN-TLR2通路在其中发挥的作用,为脓毒症相关性血小板减少症的发病机制提供基础研究证据,为改善脓毒症相关性血小板减少症患者的预后提供可能的治疗靶点。
体外条件下,LPS诱导人血小板凋亡的研究及TLR4的介导作用制备人洗涤血小板,浓度梯度组用不同浓度的LPS分别与洗涤血小板进行体外孵育,观察LPS对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的LPS最适浓度。TLR4单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照,观察TLR4单克隆抗体阻断前后,LPS对血小板凋亡诱导作用的变化。
体外条件下,PGN诱导人血小板凋亡的研究及TLR2的介导作用制备人洗涤血小板,浓度梯度组用不同浓度的PGN分别与洗涤血小板进行体外孵育,观察PGN对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的PGN最适浓度。TLR2单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照,观察TLR2单克隆抗体阻断前后,PGN对血小板凋亡诱导作用的变化。
方法制备洗涤血小板,建立体外反应体系,分别设置LPS/PGN浓度梯度实验组及TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验组,以凝血酶诱导的血小板凋亡作为阳性对照,应用流式细胞技术测定不同处理组血小板的PS外翻及ΔΨ去极化,应用凋亡蛋白抗体芯片法筛查血小板凋亡相关蛋白的表达水平,应用蛋白印记技术检测促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果LPS及PGN均以浓度依赖性为特点诱导血小板发生PS外翻及ΔΨ去极化。凋亡蛋白抗体芯片结果显示,在LPS及PGN刺激下,血小板多种凋亡相关蛋白的表达发生变化,主要以促凋亡蛋白的升高及抗凋亡蛋白的降低为主。WesternBlot结果提示LPS及PGN诱导下,血小板促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax及Bak的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达也呈增高趋势。
而TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验表明,LPS-TLR4/PGN-TLR2通路至少部分介导了LPS/PGN诱导的血小板凋亡的发生。
结论1.LPS及PGN均可诱导血小板发生凋亡,表现为PS外翻、ΔΨm去极化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、Bak、Bax及Bcl-2等凋亡相关蛋白表达增高;
2. 内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径均参与了LPS/PGN诱导的血小板凋亡;
3.TLR4参与了LPS诱导的血小板凋亡的发生,TLR4单克隆抗体至少可以部分阻断LPS诱导的血小板凋亡;TLR2参与了PGN诱导的血小板凋亡的发生,TLR2单克隆抗体至少可以部分阻断PGN诱导的血小板凋亡。
参考文献
[1]NK cells and T cells cooperate during the clinical course of colorectal cancer[J].Giuseppe Sconocchia,Serenella Eppenberger,Giulio C Spagnoli,Luigi Tornillo,Raoul Droeser,Sara Caratelli,Francesca Ferrelli,Andrea Coppola,Roberto Arriga,Davide Lauro,Giandomenica Iezzi,Luigi Terracciano,Soldano Ferrone.OncoImmunology.2014(8)
[2]Gram-positive and gram-negative bacterial toxins in sepsis[J].Girish Ramachandran.Virulence.2014(1)
[3]Role for Platelet Glycoprotein Ib-IX and Effects of its Inhibition in Endotoxemia-Induced Thrombosis,Thrombocytopenia,and Mortality[J].Hong Yin,Aleksandra Stojanovic-Terpo,Weidong Xu,Adam Corken,Alexander Zakharov,Feng Qian,Sasha Pavlovic,Aleksandar Krbanjevic,Alexander V.Lyubimov,Zaijie J.Wang,Jerry Ware,Xiaoping Du.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2013(11)
[4]In vitro effects of nitric oxide donors on apoptosis and oxidative/nitrative protein modifications in ADP-activated platelets[J].Sener,A,Egemen,G,Cevik,O,Yanikkaya-Demirel,G,Apikoglu-Rabus,S,Ozsavci,D.Human and Experimental Toxicology.2013(3)
[5]王淑娟.脂多糖/肽聚糖诱导人血小板凋亡的体外研究[D].天津医科大学,2015.