背景[1-3]
血液RNA提取试剂盒适用于从新鲜全血(用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的血液样品)中提取总RNA，可处理多至1.5ml的全血，洗脱得到分子量大于200 bp的高纯度RNA，多个样品可以在1小时内同时完成。本产品无需CsCl纯化的超离心步骤和LiCl或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶剂，经过纯化的RNA有效去除血红素、肝素等酶抑制剂和污染物，可直接用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。
血液RNA提取试剂盒
产品特点:
针对血液样本独特配置,操作更简单、流程更优化。
配有高效的DNaseⅠ,可有效去除DNA污染。
配有CS过滤柱,可有效去除其它杂质。
RNA纯度更高,无杂质残留,特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
操作安全可靠,无需酚/氯仿抽提,无需氯化铯梯度离心,无需氯化锂或乙醇沉淀。
操作步骤：
1、向新鲜的抗凝全血样本中，加入5倍血液样本体积的1×Buffer RBL(请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍)，轻轻涡旋或颠倒混匀。冰上孵育10-15分钟，孵育过程中混匀两次。
注意：孵育过程中浑浊的悬液会变成透明，证明红细胞被裂解，必要时可以把孵育时间延长至20分钟。
2、4℃2,100 rpm(~400×g)离心10分钟，小心吸弃上清。
3、向以上沉淀中加入2倍血液样本体积的1×Buffer RBL(请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍)，轻轻涡旋，充分重悬沉淀。
4、4℃2,100 rpm离心10分钟，小心并彻底吸弃上清。
注意：此步一定要完全去除上清否则影响裂解导致RNA产量下降。
5、向沉淀中加入Buffer RL(使用前检查是否已经加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表进行，涡旋混匀。
6、将以上所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，12000rpm(~～13400×g)离心2分钟，收集滤液，弃掉过滤柱。
7、向滤液中加入1倍体积(600μl或350μl)的70%乙醇(无RNase水配制)，混匀。
8、将上步所得溶液全部加入到吸附柱中(已装入收集管)，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。
11、向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。
12、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
13、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
14、重复步骤13。
15、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
16、将吸附柱置于一个新的RNase-Free的1.5ml离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
应用[4][5]
用于血液样本处理对RNA测序数据影响的研究
以血液这一最为常用的临床样本为研究对象,重点研究了血液储存时间以及外周血单核细胞（PBMC）样本分离方法对其RNA测序数据质量的研究,对测序数据质量及准确度进行了探索分析,在差异表达基因分析的基础上找到了一些规律性变化且与储存时间相关的基因。
该研究能够拓展高通量测序在临床相关研究中的应用,促进其进一步发展。论文的主要研究内容如下:1)在PBMC样本研究中,通过比较不同样品处理间的基因表达差异,发现随着贮藏时间的延长,差异逐渐扩大,而对总基因的影响不显著。在PBMC测序数据中发现了5个随时间呈梯度差异的基因,它们都是免疫相关基因,这些基因在以前的研究中没有提及,这提示我们按照常规的生物标记分子筛选方法而不注重样本处理无疑会产生偏差。此外,离心速度的影响大于保存时间,不同的离心速度可诱导差异表达。本文还分析了不同的贮存时间和离心速度对相同样品的影响,为血液保存时期如何操作和处理样本提供了理论依据。
2) 在全血样本研究中,通过比较相同样品不同储存时间的基因表达差异,发现24小时之内的基因表达差异不明显。甚至于,人群差异大于储存时间影响。然而,全血与PBMC的测序结果表明,大部分差异基因与红细胞功能相关,这很有可能是血红蛋白的权重太大造成的背景干扰。
因此,全血试剂盒提取RNA替代传统PBMC提取虽然操作简便,但血红蛋白基因相关的背景干扰影响了结果。
参考文献
[1]Exploring the effect of library preparation on RNA sequencing experiments[J].Lei Wang,Sara J.Felts,Virginia P.Van Keulen,Larry R.Pease,Yuji Zhang.Genomics.2019(6)
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[3]An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations.[J].Dube Umber,Del-Aguila Jorge L,Li Zeran,Budde John P,Jiang Shan,Hsu Simon,Ibanez Laura,Fernandez Maria Victoria,Farias Fabiana,Norton Joanne,Gentsch Jen,Wang Fengxian,Salloway Stephen,Masters Colin L,Lee Jae-Hong,Graff-Radford Neill R,Chhatwal Jasmeer P,Bateman Randall J,Morris John C,Karch Celeste M,Harari Oscar,Cruchaga Carlos.Nature neuroscience.2019(11)
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[5]欧阳汀兰.血液样本处理对RNA测序数据影响的研究[D].东南大学,2020.