背景[1-3]
优级胎牛血清(无噬菌体低内毒素)采自引产胎牛，经3次100nm过滤，无噬菌体，内毒素含量极低≤5EU/ml，极佳的促细胞生长繁殖效果。优级胎牛血清适合于细胞株的保藏及组织器官培养、单抗研制、绝大多数肿瘤细胞。
内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有成分。当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。国际上规定，胎牛血清的级别，应以内毒素水平的高低来确定，其中，特级胎牛血清的内毒素应<10EU/ml。
优级胎牛血清(无噬菌体低内毒素)
产品特点
pH值（25℃）：7.0~8.5
总蛋白含量（g/L）：35~45
血红蛋白含量（g/L）：≤200
细菌内毒素含量（EU/mL）：≤5
渗透压摩尔浓度（mOsmol/Kg）：250~330
牛腹泻、牛腺、牛细小、呼肠孤、牛副流感、狂犬病毒检测结果均为阴性
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
应用[4][5]
用于外周血EPCs的体外培养及aspirin对EPCs迁移功能影响的研究
通过研究,探索改进人外周血中EPCs分离和体外培养的方法,探明人外周血中EPCs体外培养的生长特征,找寻细胞干预时期,为人外周血EPCs的研究奠定基础。同时,利用Transwell培养皿模拟体外EPCs的迁移过程,观察阿司匹林对EPCs的体外迁移功能的影响,旨在为临床缺血性血管疾病治疗中阿司匹林的合理应用提供参考。
方法:人类外周血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定:无菌条件下采集健康捐献者外周静脉血20ml,运用Ficoll密度梯度离心法,将常规的2000rpm调整至1200rpm,分离外周血中单个核细胞（MNCs）,经过细胞计数,台盼蓝染色鉴定细胞活力后,用含有10%优级胎牛血清的人类内皮祖细胞培养基按常规进行培养。对培养所得的细胞每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态学变化,观测评价细胞生长过程。并进行EPCs特征和功能的鉴定:1、VEGFR-2、CD133、vWF的免疫荧光检测;2、细胞摄取acLDL和结合UEA-1实验。
阿司匹林对内皮祖细胞迁移功能的影响:在部分研究的基础上,选择培养7天的细胞进行这一步研究。将培养7天的细胞消化,重悬,计数后将悬液放入Transwell培养皿的上室。将含有不同浓度阿司匹林的含血清培养液加入到Transwell培养皿的下室,将Transwell培养皿放入细胞培养箱中培养24h后计数迁移到低层的细胞,以观察评价细胞迁移能力。通过与无阿司匹林的含血清培养液组比较,观测不同浓度作用相同时间或同一浓度作用不同时间,阿司匹林对人外周血中EPCs迁移功能的影响。
结果:将离心速度调整至1200rpm后,每ml外周血经Ficoll密度梯度离心法分离可得到MNCs 1×10~6～2×10~6个,台盼蓝染色后活细胞百分率在95±3%。培养后早期细胞大多为圆形或椭圆形,混有少量纺锤形细胞,第5天起,部分圆形大单核细胞转化为梭形贴壁内皮祖细胞;7天左右出现由数十个细胞形成的细胞集落,并可见到细胞呈条索状排列;10天左右,细胞变为长梭形,相互交联;14天后细胞开始衰老、崩解,数量减少。在培养的第7天,细胞生长性状,通过检测,细胞的内皮祖细胞系特异性标志因子VEGFR-2、CD133与vWF表达良好,摄取acLDL和结合UEA-1实验均呈强阳性。
选取培养第7天的细胞,采用Transwell培养皿检测阿司匹林对EPCs迁移能力的影响,在200倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞。无阿司匹林对照组26.8±1.73,加入1mmol/L阿司匹林组24.3±1.94,加入2mmol/L阿司匹林组20.1±2.57,加入5mmol/L阿司匹林组13.1±1.87,加入10mmol/L阿司匹林组9.2±1.58。经统计分析证实,加入阿司匹林组Transwell膜底面细胞数较对照组显著减少,随着加入阿司匹林的浓度增加,Transwell膜底面细胞数的减少幅度更为明显。
参考文献
[1]Suppression of Endothelial Progenitor Cells in Human Coronary Artery Disease by the Endogenous Nitric Oxide Synthase Inhibitor Asymmetric Dimethylarginine[J].Thomas Thum,Dimitrios Tsikas,Sylvia Stein,Maximilian Schultheiss,Martin Eigenthaler,Stefan D.Anker,Philip A.Poole-Wilson,Georg Ertl,Johann Bauersachs.Journal of the American College of Cardiology.2005(9)
[2]Endothelial Progenitor Cells Are Recruited Into Resolving Venous Thrombi[J].B Modarai,KG Burnand,B Sawyer,A Smith.Circulation.2005(20)
[3]Endothelial Progenitor Cells During Cerebrovascular Disease[J].Usman Ghani,Ashfaq Shuaib,Abdul Salam,Aman Nasir,Umar Shuaib,Tom Jeerakathil,Faiz Sher,Fintan O’Rourke,Abdul Majeed Nasser,Brenda Schwindt,Kathryn Todd.Stroke.2005(1)
[4]Depletion of Endothelial Progenitor Cells in the Peripheral Blood of Patients With Rheumatoid Arthritis[J].Johannes Grisar,Daniel Aletaha,Carl W.Steiner,Theresa Kapral,Sabine Steiner,Daniela Seidinger,Günter Weigel,Ilse Schwarzinger,Wolfgang Wolozcszuk,Günter Steiner,Josef S.Smolen.Circulation.2005(2)
[5]刘慧权.外周血EPCs的体外培养及aspirin对EPCs迁移功能影响的研究[D].天津医科大学,2008.