背景[1-3]
人B细胞活化因子受体包括BAFF-R、BCMA(B细胞成熟抗原)和TACI三种。BAFF-R为特异性受体，是介导外周B细胞发育的最主要受体；BCMA和TACI则是与APRIL共有的受体。
B细胞活化因子（BAFF）是TNF配体超家族成员，由巨噬细胞，树突细胞和T淋巴细胞产生。BAFF促进B细胞的存活，对B细胞成熟至关重要。BAFF与三种TNF受体超家族成员结合：B细胞成熟抗原（BCMA/TNFRSF17），跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用物（TACI/TNFRSF13B）和BAFF受体（BAFF R/BR3/TNFRSF 13C）。这些受体是缺乏信号肽的III型跨膜蛋白。尽管TACI和BCMA结合BAFF和另一种TNF超家族配体APRIL（增殖诱导配体），但BAFF R选择性结合BAFF。
人B细胞活化因子受体
BAFF R细胞外结构域缺乏TNF受体经典的富含半胱氨酸的结构域（CRD）并且仅含有具有四个α半胱氨酸残基的部分CRD。人和小鼠BAFF R具有56%的同一性。BAFF R在脾，淋巴结和静息B细胞中高度表达。它还在活化的B细胞，静息CD4+T细胞，胸腺和外周血白细胞中以较低水平表达。B细胞活化因子属肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF13B)，主要由单核细胞、树突状细胞及T细胞产生，可促进B细胞成熟和分化，在免疫应答中起重要作用，并与自身免疫密切相关。膜型BAFF主要表达于抗原提呈细胞，蛋白酶可使之水解而转变为可溶性BAFF。
应用[4][5]
用于B细胞活化因子及其受体信号对实验性关节炎树突状细胞和滑膜细胞功能的影响和机制及CP-25的作用研究
在佐剂性关节炎（AA）大鼠模型上观察了CP-25的治疗作用和作用特点,并在以往研究工作基础上进一步以DCs和FLS为研究细胞,运用ELISA、QRT-PCR、流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹、激光共聚焦、免疫共沉淀等技术,观察BAFF受体信号对DCs和FLS功能的影响及CP-25的作用,并在FLS中深入研究了BAFF信号和PGE2信号的相互影响及CP-25的作用机制,为探究BAFF及其受体信号参与RA异常炎症免疫反应的病理机制及阐明CP-25的作用靶点提供更多的实验依据。
方法：1.采用完全弗氏佐剂制备AA大鼠模型,CP-25灌胃给药,足爪仪测量继发侧足爪容积、计算足爪肿胀度,评分多发性关节炎指数,HE染色观察关节、脾脏病理,ELISA法检测BAFF和IL-1p水平,Western blot法和QRT-PCR法检测脾脏组织中BAFF的三个受体BAFF-R、TACI、BCMA表达,免疫组化法检测脾脏DCs的分布和数量,流式细胞术检测AA大鼠脾脏DCs的活化表型CD40,CD80,CD86和MHCII的表达；
2. 无菌取大鼠骨髓源细胞,经rGM-CSF、rIL-4共刺激诱导生成骨髓源DCs,CCK-8法检测BAFF-DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应（MLR）,RT-PCR法检测DCs上BAFF-R,TACI、BCMA,以及CP-25对BAFF-DCs和COX2和BAFF的表达,QRT-PCR法检测CP-25对BAFF-DCs IL-1β和TNF-α表达的影响,ELISA法检测BAFF-DCs上清中PGE2水平及CP-25的作用、流式细胞术检测BAFF-DCs表面BAFF的三个受体BAFF-R、TACI、BCMA表达,以及CP-25对BAFF-DCs抗原吞噬功能和表型CD40,CD86和MHCII的表达和细胞凋亡率的影响,Western blot法检测CP-25对BAFF-DCs上TACI、BAFF-R、凋亡相关蛋白及ERK/NF-kB信号通路蛋白表达的影响；
3. CCK-8法检测BAFF-DCs对AA大鼠FLS以及BAFF对MH7A的促增殖作用和CP-25的影响,Transwell法检测BAFF-DCs对AA大鼠FLS的迁移和侵袭功能影响及CP-25的作用,QRT-PCR法检测CP-25对BAFF-DCs与AAFLS共培养后FLS中MMP9表达的变化和BAFF对MH7A细胞分泌炎症细胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α的影响。Western blot法检测CP-25对BAFF刺激人RA滑膜细胞株MH7A细胞中COX2表达的影响,ELISA检测CP-25对BAFF刺激MH7A细胞上清中PGE2水平和细胞内cAMP水平的影响；
4.RT-PCR、流式细胞术以及细胞免疫荧光法检测MH7A细胞中BAFF及其受体的表达,激光共聚焦观察BCMA和TRAF2在MH7A细胞中的共定位情况,Western Blot检测BAFF对MH7A细胞中BCMA、下游连接蛋白TRAF2和NF-kB信号通路蛋白的影响及CP-25的作用,免疫共沉淀法检测BAFF对MH7A细胞TRAF2与GRK2共表达的影响及CP-25的作用,免疫荧光法检测MH7A细胞上EPs受体四种亚型的表达情况,QRT-PCR检测PGE2-EP4信号通路在BAFF对MH7A细胞分泌功能中的影响,超速离心法分离胞浆胞膜蛋白,Western blot检测BAFF对PGE2刺激MH7A细胞膜表达EP4受体和GRK2的影响及CP-25的作用,流式细胞术检测BAFF对EP4激动剂处理不同时间MH7A细胞EP4受体膜表达的变化及CP-25的作用,ELISA检测BAFF对EP4激动剂处理不同时间MH7A细胞内cAMP水平的变化及CP-25的作用,免疫共沉淀法检测BAFF对PGE2刺激MH7A细胞EP4与GRK2共表达的影响及CP-25的作用。
参考文献
[1]Feedback Regulation of G Protein-Coupled Receptor Signaling by GRKs and Arrestins[J].Joseph B.Black,Richard T.Premont,Yehia Daaka.Seminars in Cell and Developmental Biology.2015
[2]GRK6 phosphorylates IκBαat Ser 32/Ser 36 and enhances TNF-α-induced inflammation[J].Yuki Ohba,Michio Nakaya,Kenji Watari,Akiomi Nagasaka,Hitoshi Kurose.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2015(2)
[3]Betalactam antibiotics affect human dendritic cells maturation through MAPK/NF-kB systems.Role in allergic reactions to drugs[J].Soledad Lopez,Enrique Gomez,Maria J.Torres,David Pozo,Tahia D.Fernandez,Adriana Ariza,Maria L.Sanz,Miguel Blanca,Cristobalina Mayorga.Toxicology and Applied Pharmacology.2015(3)
[4]Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype–positive rheumatoid arthritis patients[J].Helen Benham,Hendrik J.Nel,Soi Cheng Law,Ahmed M.Mehdi,Shayna Street,Nishta Ramnoruth,Helen Pahau,Bernett T.Lee,Jennifer Ng,Marion E.G.Brunck,Claire Hyde,Leendert A.Trouw,Nadine L.Dudek,Anthony W.Purcell,Brendan J.O’Sullivan,John E.Connolly,Sanjoy K.Paul,Kim-Anh LêCao,Ranjeny Thomas.Science Translational Medicine.2015(290)
[5]魏芳.B细胞活化因子及其受体信号对实验性关节炎树突状细胞和滑膜细胞功能的影响和机制及CP-25的作用[D].安徽医科大学,2016.