背景[1-3]
人白细胞介素-2(IL-2)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液中IL-2的含量。
原理：预先包被的抗体为IL-2单克隆抗体。检测相抗体为IL-2多克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zuì终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-2呈正相关。
人白细胞介素-2(IL-2)ELISA试剂盒
IL-2即白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2），又名T细胞生长因子(T cell growth factor，TCRF).主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子.是所有T细胞亚群的生长因子，并可促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视.环孢素等免疫抑制剂可以抑制其活性和生成。
白介素2首先被发现对骨髓来源的T细胞有生长促进作用。此后，发现IL-2的作用谱越来越广，包括对T、B细胞、NK细胞、LAK细胞、单核巨噬细胞和少突胶质细胞都有直接的促进生长和分化作用。作用通过细胞膜上的IL-2受体而实现。由于IL-2对免疫系统所具有的广泛作用，其在临床上有着良好的应用。人的IL-2的前体有153个氨基酸。成熟形态有133个氨基酸，分子量为15.5KDa的糖蛋白。
应用[4][5]
用于人白介素-2和人血清白蛋白融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究
利用毕赤酵母对人白介素-2（IL-2）和人血清白蛋白（HSA）融合蛋白进行表达,分别将IL-2连在HSA的N-端（IL-2-HSA）和C-端（HSA-IL-2）得到的融合蛋白都具有良好的生物学活性,其半衰期也由IL-2单体的6.9 min延长至13.24 h。但在研究中发现,毕赤酵母在表达HSA融合蛋白时存在蛋白降解、产物不均一和过度糖基化等现象,导致分离纯化困难,活性下降以及半衰期缩短等问题,这些不利因素限制了毕赤酵母在表达IL-2融合蛋白中的应用。
目前中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）已成功应用于多种药物蛋白的表达,因此本研究将IL-2和HSA的融合蛋白在CHO细胞中进行表达,对筛选得到的工程细胞株的生长状态和蛋白表达进行了检测,同时对融合蛋白的分离纯化策略和生物活性进行了分析。
本研究利用基因工程技术构建两种不同连接方式的融合蛋白表达质粒,并通过电转染的方法分别转入CHO细胞中,经过四次克隆筛选和摇瓶终筛获得了高效表达HSA-IL-2融合蛋白的细胞株CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和表达IL-2-HSA融合蛋白的细胞株CHO/p MH3-IL-2-HSA/8。进行Western blot检测后发现两种融合蛋白都具有HSA和IL-2双重免疫原性,CTLL-2/MTT法检测发现,筛选得到的细胞株分泌表达的融合蛋白都具有一定的生物活性。
对筛选得到的细胞株进行3 L摇瓶流加培养,CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和CHO/p MH3-IL-2-HSA/8在流加培养期间细胞密度最高分别达到6.4×106 cells·m L-1和6.7×106 cells·m L-1,七天积累表达量分别为138 mg·L-1和118 mg·L-1,SDS-PAGE和Western blot检测未发现明显的降解条带。对表达产物进行分离纯化,初步确定了融合蛋白的分离纯化步骤:发酵液经离心、微滤后,再依次经过Blue Sepharose、Phenyl Sepharose和Q Sepharose层析,获得的融合蛋白HSA-IL-2和IL-2-HSA纯度分别为96.5%和95.3%,纯化回收率分别为17.29%和14.77%。CTLL-2/MTT法检测融合蛋白生物活性,HSA-IL-2的比活性约为1.03×107 IU·mg-1,IL-2-HSA约为8.3×106 IU·mg-1,与毕赤酵母表达IL-2-HSA融合蛋白的生物活性水平基本相当。
参考文献
[1]Constitutive Expression of a rhIL-2-HSA Fusion Protein in Pichia pastoris Using Glucose as Carbon Source[J].Bo Guan,Fengxiang Chen,Jianyong Lei,Yunhua Li,Zuoying Duan,Ruiyu Zhu,Yun Chen,Huazhong Li,Jian Jin.Applied Biochemistry and Biotechnology.2013(7)
[2]Anti‐cell death engineering of CHO cells:Co‐overexpression of Bcl‐2 for apoptosis inhibition,Beclin‐1 for autophagy induction[J].Jae Seong Lee,Tae Kwang Ha,Jin Hyoung Park,Gyun Min Lee.Biotechnol.Bioeng..2013(8)
[3]Rapid construction of transgene-amplified CHO cell lines by cell cycle checkpoint engineering[J].Kyoung Ho Lee,Masayoshi Onitsuka,Kohsuke Honda,Hisao Ohtake,Takeshi Omasa.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(13)
[4]A universal nanoparticle cell secretion capture assay[J].Wendy Fitzgerald,Jean‐Charles Grivel.Cytometry.2012(2)
[5]卢慧惠.人白介素-2和人血清白蛋白融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的表达[D].江南大学,2015.