背景[1-3]
PCR产物纯化试剂盒是一种用于PCR产物纯化或从多种DNA反应体系中纯化DNA的试剂盒。
PCR产物纯化试剂盒适用于PCR反应后去除引物、酶、矿物油、甘油、盐等杂质；也同样适用于酶切、连接、磷酸化、补平或切平、随机引物等反应后的DNA纯化。纯化所得DNA可直接用于酶切、连接、转化细菌、测序、PCR、杂交等后续操作。本试剂盒适用于纯化100bp-10kb DNA，长至30个碱基的引物均可被完全去除。
PCR产物纯化试剂盒
PCR产物纯化试剂盒采用了一种新型的DNA纯化柱。在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间，结合到DNA纯化柱上，在一定条件下又能将DNA充分洗脱，从而实现DNA的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需不足15分钟即可完成。
每个DNA纯化柱可以结合的DNA量的上限约为15微克。DNA回收效率约为90%。接近100bp或10kb的DNA片段回收效率要略低一些，大于10kb的DNA回收效率迅速下降。另外如果样品中DNA含量特别低也会导致回收效率下降。
注意事项：
次使用前在溶液II(洗涤液)中加入39ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
溶液I对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
应用[4][5]
用于建立东海几种重要赤潮藻的LAMP-LFD检测技术的研究
以东海常见的3种赤潮藻,即强壮前沟藻（Amphidinium carterae）、链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）和米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）为目标,将环介导等温扩增（loop–mediated isothermal amplification,LAMP）与横向流动试纸条（lateral flow dipstick,LFD）结合,分别建立其LAMP–LFD检测技术。论文以目标藻转录内间隔区（internal transcribed spacers,ITS）或核糖体大亚基（large subunit,LSU）为检测靶标,首先通过基因组DNA提取和克隆测序获得靶序列,根据靶序列进行LAMP引物和检测探针的设计、合成与筛选;其次,建立目标藻的LAMP–LFD检测体系,对LAMP反应体系进行优化;最后对LAMP–LFD技术的特异性、灵敏度及实用性进行验证评估。
对强壮前沟藻的ITS序列进行克隆,并用其设计1套LAMP引物及1条检测探针;对LAMP反应体系进行优化后用我国东海沿岸常见微藻作为受试对象,对LAMP–LFD进行交叉反应测试,表明LAMP–LFD对强壮前沟藻具有特异性;分别以强壮前沟藻基因组DNA和ITS克隆质粒为模板进行灵敏度测试,显示LAMP–LFD的检测限分别为8.34×10-44 ng·μL-1和1.86×10~4 copies·μL-1,灵敏度均比常规PCR高100倍;模拟自然水样测试得LAMP–LFD对目标藻的检测限为约10 cells·mL-1,灵敏度比常规PCR高10倍。
对链状亚历山大藻ITS序列进行克隆,以其为靶序列成功设计3套LAMP引物（AcLF1、AcLF2和AcLF3）,筛选确定引物AcLF2,并设计1条检测探针;用引物建立检测体系并进行优化;交叉反应测试显示LAMP–LFD对链状亚历山大藻具有特异性;LAMP–LFD对链状亚历山大藻基因组DNA和ITS克隆质粒的检测限为4.63×10-4ng·μL-1和1.26×10~4copies·μL-1,均显示其灵敏度比常规PCR高100倍;模拟水样测试显示,LAMP–LFD对目标藻的检测限约为10-11 cells·mL-1,灵敏度较常规PCR高100倍。克隆米氏凯伦藻ITS序列,并用其设计2套LAMP引物（KmLF1和KmLF2）,用实验室前期获得的LSU序列再设计2套引物（KmLF3和KmLF4）,对4套引物进行筛选确定引物KmLF3,并根据LSU序列设计1条检测探针;优化建立的LAMP体系;交叉反应测试得LAMP–LFD能特异性地检测米氏凯伦藻;LAMP–LFD对米氏凯伦藻基因组DNA的检测限为1.70×10-4ng·μL-1,灵敏度较常规PCR高100倍,对米氏凯伦藻LSU克隆质粒检测限为6.21×10~3copies·μL-1,其灵敏度是LAMP和SYBR Green I染料的10倍,是常规PCR的1000倍;模拟水样检测得LAMP–LFD检测限约为10-11 cells·mL-1,其灵敏度是常规PCR的1000倍。综上所述,建立的LAMP–LFD检测方法是一种快速准确的赤潮藻分子检测技术。
参考文献
[1]The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection of Karlodinium veneficum[J].Hai-Long Huang,Peng Zhu,Cheng-Xu Zhou,Shan He,Xiao-Jun Yan.Harmful Algae.2017
[2]Understanding how physical-biological coupling influences harmful algal blooms,low oxygen and fish kills in the Sea of Oman and the Western Arabian Sea[J].Paul J.Harrison,Sergey Piontkovski,Khalid Al-Hashmi.Marine Pollution Bulletin.2017(1)
[3]Rapid and sensitive detection of Babesia bovis and Babesia bigemina by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Yimin Yang,Qun Li,Suhua Wang,Xueqiu Chen,Aifang Du.Veterinary Parasitology.2016
[4]Hyperbranched rolling circle amplification as a novel method for rapid and sensitive detection of Amphidinium carterae[J].Guofu Chen,Panpan Cai,Chunyun Zhang,Yuanyuan Wang,Shibei Zhang,Changlu Guo,Dou Ding Lu.Harmful Algae.2015
[5]王亮.建立东海几种重要赤潮藻的LAMP-LFD检测技术[D].哈尔滨工业大学,2018.