D-叔亮氨酸

背景及概述^[1]

D-叔亮氨酸是非常重要的非天然氨基酸，是多种药物的中间体。因其侧链是一个叔丁基，有很大的空间位阻，在和其它分子耦联后有利于维持空间构象，同时形成的酰胺键不容易被体内的酶识别降解。氨基酸是指既含有氨基的羧酸的有机化合物，不同氨基酸的之间区别在于它们侧 链R基团的不同，自然界中到目前为止共发现有300多种氨基酸，根据是否是构成天然蛋白 质的基本组成成分，氨基酸可分为天然氨基酸和非天然氨基酸，非天然氨基酸是指人工合 成的各种氨基酸。除甘氨酸外，氨基酸都有不对称碳原子，呈旋光性，根据空间排列位置不 同，可以分为D-氨基酸和L-氨基酸两种，不同旋光氨基酸在生物体内发挥着不同的生理作 用。

制备^[1]

一种改造的来源于Symbiobacterium thermophihum的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)变体生物催化剂，该催化剂可以被用来还原氨化合成ee值＞99％的D-叔亮氨酸。

突变酶蛋白的获取步骤如下：

1.以pET32-Dapdh质粒为模板，通过QuickChangeMutagenesisKit突变试剂盒引入W121L、F146L、H227F三位点组合突变，并对突变质粒进行测序验证；

2.将突变质粒以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌构建成工程菌；

3.对构建的工程菌进行培养、诱导表达，突变体蛋白以可溶性形式存在于胞内；

4.将突变体蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化至SDS-PAGE单条带；

5.将纯化后的突变子蛋白脱盐浓缩，用于建立催化反应体系。

D-叔亮氨酸合成方法为：

在葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅酶NADPH循环再生体系的存在下，反应体系中的底物3，3-二甲基-2-羰基丁酸和氯化铵，在加入生物催化剂StDAPDH突变体后，于30℃反应24小时，每毫升反应体系中生物催化剂的用量约为0.5U。

反应产物构型检测方法为：

向反应产物中加入高氯酸/加热变性蛋白质后，离心取上清，对上清中的产物进行FDAA衍生，利用L、D-叔亮氨酸标样做对照，经高效液相色谱进行分析，根据产物的保留时间，确定产物构型以及ee值。

参考文献

[1]CN201310459718.2D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法