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芥子碱硫氰酸盐的制备方法和应用

发布日期:2019/2/21 15:21:31

背景及概述[1][2]

十字花科植物萝卜种子莱菔子主要成分之一的芥子碱硫氰酸盐具有来源广、成本低、不良反应很少的特点。大量研究表明芥子碱硫氰酸盐有降血压作用,本研究进一步证实其具有预防性阻止血脂血糖升高、延缓IR、AS和HCS等作用,其机制与调控肝脂质代谢和骨骼肌MAPK信号通路相关蛋白表达有关。提示芥子碱硫氰酸盐在糖尿病、高血压的前期亚健康状态时HPF预防性治疗方面显示出良好的应用前景。

应用 [1-2]

 1)治疗阿尔茨海默病:芥子碱硫氰酸盐对乙酰胆碱酯酶的抑制作用、钙通道作用、NO抑制作用,发现芥子碱硫氰酸盐在体内外均具有抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,简称AChE)的作用,也就是说芥子碱硫氰酸盐可以通过抑制 AChE,从而抑制了乙酰胆碱的水解,使体内乙酰胆碱堆积呈现出类似胆碱受体激动剂的效果。因为在众多防治AD的药物种类中,AChE抑制剂是治疗AD最有效的药物之一。高血压又是AD三大危险因素之首,芥子碱硫氰酸盐如果能够同时实现降压且治疗AD将成为新一代AD治疗药物。十字花科植物果实油菜籽粕中含有大量芥子碱硫氰酸盐成分,芥子碱硫氰酸盐具有降压、平喘、舒张平滑肌、抑制胆碱酯酶活性功能,研究发现芥子碱硫氰酸盐抑制乙酰胆碱酯酶活性、拮抗钙离子及抑制一氧化氮作用时,能够改善阿尔海默病模型鼠的认知功能,芥子碱硫氰酸盐浓度升高,抑制乙酰胆碱酯酶作用增强,半数抑制浓度为24.86mg/ml,芥子碱硫氰酸盐低剂量时是钙离子拮抗剂,芥子碱硫氰酸盐低剂量时抑制一氧化氮作用显著,芥子碱硫氰酸盐可结合三条途径发挥治疗AD的作用。

2)芥子碱硫氰酸盐抑制IR小鼠血脂血糖升高、动脉粥样硬化及肝细胞脂肪变性。其作用机制为:一方面,芥子碱硫氰酸盐通过抑制TNFα的产生,减轻肝细胞的损伤,延缓AS和HCS进程。研究证实,OB与肝内脂质异常代谢和骨骼肌脂质转运酶异常表达密切相关。有报道表明,钩藤总碱与芥子碱硫氰酸盐配伍能调控TNFα导致的血管内皮细胞变化。肝细胞是维持和调控脂质代谢的主要场所,肝细胞受损可影响脂质代谢和调控,形成病理性肥胖状态。另有报道,慢性低度炎症与OB诱发的IR类似,器官长期低度炎症而减弱器官对胰岛素的敏感性,形成IR。由于脂肪细胞可分泌较多炎性因子TNFα,活化胰岛素靶细胞炎性通路JNK和IKKβ等,激活下游AP1和NFκB而促进TNFα和IL6表达,加重慢性低度炎症,促进血管内皮细胞和肝细胞的损伤。本研究发现,在第12周,高脂饲料各组的TNFα显著高于CG,芥子碱硫氰酸盐呈现剂量依赖性降低TNFα,表明高脂饲料可导致血管内皮细胞和肝细胞周围长期慢性低度炎症而受损,芥子碱硫氰酸盐能抑制TNFα的产生,保护血管内皮细胞和肝细胞,维持其正常代谢,延缓AS和HCS进程。另一方面,芥子碱硫氰酸盐通过调控肝细胞相关信号通路蛋白表达,维持其正常脂质代谢,从而削弱HRF。HMGR是肝细胞合成胆固醇的关键限速酶,抑制HMGR可上调肝细胞膜LDLR而加快胆固醇(CH)的摄取,降低血CH,使VLDL生成减少和促进VLDL残粒(难转化成VLDL)或βVLDL异化而降低血LDL。FAS是结合死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞凋亡分子,介导T细胞毒性。肝内T细胞活化可诱导FAS和FASL表达,触发靶细胞程序性凋亡。同时,活化的相邻T淋巴细胞FAS与FASL也可彼此杀伤。SCD1是脂肪细胞分泌的瘦素信号靶基因,能使硬脂酰辅酶A与棕榈酰辅酶A去饱和,维持体重,减少进食和加快能量消耗。高脂饮食可下调SCD1表达,降低肝细胞FFA去饱和力而沉积。油酰辅酶A(SCD1产物)可促进肝细胞神经酰胺合成,增加脂肪沉积和升高肝重指数。CPT1是脂肪酸-氧化限速酶,若表达上调,脂肪酸氧化减慢,血糖降低,HCS减轻。酰基辅酶A氧化酶是脂肪细胞内与脂肪酸的氧化有关的起始酶,可降低TC,延缓OB、IR和HCS进程。肝细胞内质网的SREBP2是细胞TC代谢转录调节物,当CH缺乏时,SREBP2激活,干扰TC外源性吸收,增加TC逆转运和内源性TC转化为胆汁酸,而降低血TC。本研究证实,SG和RG的FAS、SCD1和CPT1A蛋白表达均显著强于CG,而HMGR低于CG;芥子碱硫氰酸盐呈剂量依赖性增加HMGR、ACOX1和SREBP2蛋白表达而抑制LDLR、FAS、SCD1和CPT1A蛋白表达。提示芥子碱硫氰酸盐以上述多信号路径的调控形式维持正常肝脂质代谢,减缓HRF的发生。此外,芥子碱硫氰酸盐还通过调控骨骼肌MAPK信号通路相关蛋白表达,阻止IR进程。IR和OB与骨骼肌胰岛素抵抗密切相关,骨骼肌是代谢能量物质(糖、脂等)的重要场所,可处置70% ~90%葡萄糖,与血脂、血糖、IR、AS及HCS密切相关。MAPK在胰岛素信号转导中具有重要作用,其级联反应激活酶有ERK、JNK及P38。

制备[2-3]

方法1:从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐的方法,包括如下步骤:

1)首先将水完全没过油菜籽粕,(油菜籽粕kg:自来水L=1:4~1:10),浸泡2~6个小 时。然后放置在电加热套上加热,使用电压调节仪调节电压,使其始终保持在微沸腾状态, 每分钟搅拌5~6下,提取3~4次,每次3~5小时,提取所需水量比例比为(5:4:4:3)。用 6层纱布过滤,将滤液用旋转蒸发仪浓缩,得到浸膏。以浸膏(克):乙醇(升)=1:10~1:20 的比例用乙醇对所得浸膏进行萃取,萃取3~4次,每次3~4小时。将萃取所得溶液进行抽滤, 沉淀层丢弃,乙醇抽滤层用旋转蒸发仪进行浓缩至无醇味。

2)将浓缩至无醇味的浸膏用蒸馏水进行稀释,比例为水(升):浸膏(克)=10:1~30:1, 把稀释的溶液抽滤,加入适量的20%硫氰酸钾,根据经验公式:“所需硫氰酸钾的质量”=油 菜籽粕质量*(7%~8%)312*97”。将硫氰酸钾溶液与稀释液充分混合,置于4℃冰箱中冷却 48~72小时,后将沉淀层滤出,沉淀层即为所得芥子碱硫氰酸盐。滤除沉淀后,继续放置在4 ℃冰箱中冷却结晶12~24小时,取出过滤,如此反复结晶。将芥子碱硫氰酸盐沉淀用40℃~50 ℃的甲醇溶解,芥子碱硫氰酸盐(克):甲醇(毫升)=1:100~1:200;溶解后趁热过滤,滤 液层在室温下静置6~8小时,有灰色结晶物产生,将结晶刮出,放在减压干燥箱里干燥24~48h, 就得到芥子碱硫氰酸盐的粉末。沉淀层再用40℃~50℃甲醇溶,有部分溶解,按照上面操作 3~5次。得到纯度大于90%的芥子碱硫氰酸盐。

方法2:一套最优提取芥子碱的步骤,具体如下:

Step 1脱脂:取粉碎后的白芥子,用浓度60-90%石油醚在室温下浸提三次,每次20-28小时(优选24小时即可),其中,料液比为1克∶5-10毫升,常压脱脂。

Step 2制备浸膏:将脱脂后的白芥子用95%乙醇,50%乙醇/水,水,100%甲醇,50%甲醇/水回流提取三次,合并提取液;浓缩至无醇味,得浸膏。

Step 3制备芥子碱硫氰酸盐湿晶:将浸膏置圆底烧瓶中,按照膏液体积比1∶5-10加入20-60%硝酸水溶液,加热回流5小时,过滤;滤液用40%NaOH调pH为8-9,向滤液中再加入20%-40%硫氰酸钾,至4℃恒温冷柜中48小时,析出湿的芥子碱的硫氰酸盐晶体。

Step 4干燥:将芥子碱硫氰酸盐湿晶溶于70-90%热的乙醇,经多次重结晶,真空干燥抽滤,得到干燥的芥子碱硫氰酸盐。

主要参考资料

[1] 芥子碱硫氰酸盐抑制IR小鼠血脂血糖升高、

[2] 动脉粥样硬化及肝细胞脂肪变性

[3] CN201610128008.5 从油菜籽粕中制备芥子碱硫氰酸盐及应用

[4] CN201019000014.2 芥子碱的制备方法

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