背景[1-3]
稳转细胞株构建是通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并能随细胞分裂稳定传递下去，再用载体中所含抗性基因进行筛选。
稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。
稳转细胞株构建
稳转细胞株构建目的
①通过建立稳转细胞系，可以降低频繁转染或者病毒包装的成本，方便在目的细胞中研究基因功能实验研究；
②区别于瞬时转染只能干扰表达，无法去除已表达的目的蛋白，构建稳转细胞系可以实现更好的基因干扰效果；
③瞬转会引入极高拷贝数的表达，导致因人为因素造成实验结果的不精确，建立稳转细胞系可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究；
④需要用诱导表达系统的，主要是一些致死基因或者是需要时空表达的。
稳转细胞株构建目前常用到的方法有脂质体转染和病毒转染，病毒有慢病毒（Lentivirus），腺病毒（Adenovirus），逆转录病毒（Retrovirus）。
影响稳转细胞株构建因素
①外源基因的整合率：决定了稳转株筛选的难易程度；
②插入外源基因片段的拷贝数：通常低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；
③整合位点的转录活跃度：决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；
④外源基因片段整合到细胞后的稳定性：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。
应用[4][5]
稳转细胞株构建用于CAV-VP1蛋白多克隆抗体的制备及VP1-VP2基因共表达稳转细胞株的构建
通过构建VP1的原核截短表达重组质粒,纯化蛋白并制备相应的特异性抗体,进一步将VP1和VP2基因插入双启动子载体上,筛选稳定表达VP1和VP2的细胞株,为进一步研究CAV的致病机理以及研发CAV疫苗奠定基础。
（1）VP1截短的原核表达及多克隆抗体的制备通过DNASTAR软件分析VP1蛋白的抗原性,依据其主要存在两个抗原表位聚集区,确定截短表达基因区域为N端16-615 bp（600 bp）和616-1350 bp（735 bp）。设计两对特异性引物通过PCR扩增基因片段,将其分别连接到pET32a（+）原核表达载体上,通过菌液PCR检测、双酶切和测序等鉴定重组质粒（命名为pET32a-VP1-600和pET32a-VP1-735）,以IPTG于常温和低温诱导蛋白表达并鉴定表达形式。
结果显示,构建的pET32a-VP1-600和pET32a-VPI-735两种重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导后表达VP1-600（38 kDa）和VP1-735（48 kDa）融合蛋白,该两种蛋白均主要以包涵体形式表达。因而以8M尿素溶解包涵体蛋白后应用镍亲和层析柱纯化,经SDS-PAGE鉴定显示获得了纯度较高的VP1-600和VP1-735融合蛋白,可以作为免疫原。将上述纯化好的蛋白分别与弗氏佐剂乳化,通过皮下多点注射新西兰白兔,经四次免疫后制备抗血清,通过间接ELISA进行抗体水平的检测,以Western Blotting方法检测多抗与VP1-600和VP1-735蛋白的免疫反应。
结果获得了ELISA效价分别为1:204800、1:819200的兔抗VP1-600和VP1-735蛋白的多克隆抗体,Western Blotting检测结果显示该抗体可有效识别相应目的蛋白,表明制备的多克隆抗体能应用于VP1蛋白的检测。
（2）VP1和VP2基因共表达稳转细胞株的构建设计无缝克隆VP1、VP2的特异性引物,通过PCR分别扩增VP1、VP2全长基因,连接到双启动子真核表达载体pCB15,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经菌液PCR、酶切鉴定为阳性的克隆进行基因测序。
测序结果显示,VP2和VP1成功连接到同一个pCB15载体。将构建好的重组质粒通过脂质体转染293T细胞,用终浓度为1.5μg/mL嘌呤霉素筛选抗性细胞,通过PCR和Western Blotting对筛选的细胞进行VP1和VP2分别进行基因表达和蛋白表达的检测。
结果显示可检测细胞中VP1和VP2基因以及表达的蛋白,表明已获得稳定共表达VP1和VP2的细胞株。综上所述,本研究构建了两个VP1的原核截短表达重组质粒,通过IPTG诱导表达蛋白获得了融合蛋白,制备了两种兔抗VP1多克隆抗体;将VP1和VP2基因连接真核双启动子表达载体pCB15,获得重组质粒后转染细胞,经过嘌呤霉素筛选,成功获得稳定共表达VP1和VP2的细胞株,为进一步基于VP1和VP2共表达的CAV诱导中和抗体产生的影响机制和开发疫苗奠定基础。
参考文献
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[2]Marek’s disease virus oncoprotein Meq physically interacts with the chicken infectious anemia virus-encoded apoptotic protein apoptin.[J].Brown Andrew C,Reddy Vishwanatha R A P,Lee Joshua,Nair Venugopal.Oncotarget.2018(48)
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[5]许志伟.CAV-VP1蛋白多克隆抗体的制备及VP1-VP2基因共表达稳转细胞株的构建[D].安徽农业大学,2020.