背景[1-3]
细胞裂解液是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液,是一种相对温和的细胞裂解液,适用于提取细胞可溶性蛋白。细胞裂解液裂解细胞获得的裂解产物,可用于PAGE,蛋白印迹(Western Blot),免疫沉淀(immnolprecipitation,IP),免疫共沉淀(co-IP)和蛋白与多肽的分离纯化。
细胞裂解液的主要成分为Tris、EDTA、蔗糖,如果实验需要,需另行自备PMSF等蛋白酶抑制剂。裂解蛋白产物,可以用生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
细胞裂解液
使用说明:
1.培养细胞
(1)取出细胞裂解液,待融化后,颠倒混匀数次,可适量分装冻存。如果实验需要,按比例加入PMSF(使其最终浓度为1mM)或其他蛋白酶抑制剂,混匀,立即使用。
(2)贴壁细胞,去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍(如血清中的蛋白没有干扰,也可以不洗)。按6孔板每孔加入100-200微升的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞
充分接触。通常裂解液接触细胞数秒后细胞就会被裂解。
(3)悬浮细胞,收集培养细胞,离心去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍(如血清中的蛋白没有干扰,也可以不洗),用手指把细胞用力弹散,按6孔板每孔细胞加入100-200微升的比例加入裂解液。如果细胞数量较大,应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加裂解液。
用手指轻弹管底以促进裂解液和细胞充分接触,裂解完全时应无明显的细胞颗粒。
(4)裂解物经10,000-14,000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(5)裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。
2.组织样品
取Ep管,分别称重标记,把组织剪切成小块装入Ep管中,称重。按每20毫克组织加100-200微升的比例加入裂解液(如裂解不完全,可以适当增加裂解液的用量;如需要的蛋白样品浓度较高,可以适当减少裂解液的用量)。用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。10,000-14,000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
如果组织样品本身非常细小,如淋巴细胞,可直接加入裂解液裂解,通过振荡(Vortex)以使样品裂解完全。
应用[4][5]
细胞裂解液可以用于人脐带间充质干细胞裂解液对食管癌EC9706细胞中uPA、MMP-2的影响研究
探索hUCMSCs裂解液对食管癌EC9706细胞中uPA、MMP-2的表达的影响。为进一步研究抑制作用机理奠定理论基础。为临床应用干细胞抑制食管癌肿瘤转移的治疗方法提供理论依据。
方法1.培养食管癌EC9706细胞；2.采用组织块培养法培养hUCMSCs,待细胞传至第3代后流式细胞仪检测细胞表型；3.收集hUCMSCs,用反复冻融法制备hUCMSCs裂解液；4.各个组拥有相同数量的食管癌EC9706细胞,向每组加入不同数量的hUCMSCs裂解液,然后培养60h。使用Western-blot法检测食管癌EC9706细胞中uPA、MMP-2的表达变化。结果食管癌细胞EC9706在倒置显微镜下观察其呈多边形,形态多样,细胞核质比较大,细胞核形态不规则,细胞群体排列不规则。hUCMSCs组织块培养法原代培养7-12d后,显微镜下可见梭形或多角形成纤维细胞。随后可以发现hUCMSCs呈成纤维状,漩涡状排列。
流式细胞仪分析第3代hUCMSCs可检测到实验组各组细胞CD90、CD 166等MSCs标志物高表达,不表达造血细胞表面特异性标志CD34、CD45。当用hUCMSCs裂解液处理过食管癌EC9706细胞后,uPA在对照组中的表达为0.28075±0.00233,在1/2倍组中的表达为0.28790±0.00176,在1倍组中的表达为0.13782±0.00542,在2倍组中的表达为0.12465±0.01277。
MMP-2在对照组中的表达为0.27051±0.01956,在1/2倍组中的表达为0.26698±0.00231,在1倍组中的表达为0.13017±0.01529,在2倍组中的表达为0.11755±0.00982。当加入hUCMSCs数小于食管癌细胞数的裂解液时uPA、MMP-2的表达变化不明显(P>0.05),当加入hUCMSCs数大于或等于食管癌细胞数的裂解液时uPA、MMP-2的表达显著降低(P<0.05)。
参考文献
[1]Enhancing the Migration Ability of Mesenchymal Stromal Cells by Targeting the SDF-1/CXCR4 Axis[J].Leah A.Marquez-Curtis;;Anna Janowska-Wieczorek;;Ulrich Kneser.BioMed Research International,2013
[2]Human mesenchymal stem cells(hMSCs)target osteosarcoma and promote its growth and pulmonary metastasis[J].Wen-ting Xu;;Zhen-yu Bian;;Qi-ming Fan;;Gang Li;;Ting-ting Tang.Cancer Letters,2009(1)
[3]Human mesenchymal stem cells from bone marrow express tumor endothelialand stromal markers[J].Rebecca Bagley;;William Weber;;Cecile Rouleau;;Min Yao;;Nakayuki Honma;;Shiro Kataoka;;Isao Ishida;;Bruce Roberts;;Beverly Teicher.International Journal of Oncology,2009(3)
[4]Interactions Between Human Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer Cells[J].Panagiota A.Sotiropoulou;Sonia A.Perez;Angelos D.Gritzapis;Constantin N.Baxevanis;MichaelPapamichail.STEM CELLS,2009(1)
[5]闫国旗.人脐带间充质干细胞裂解液对食管癌EC9706细胞中uPA、MMP-2的影响[D].新乡医学院,2015.