背景[1]
HT22是小鼠海马神经元细胞系，来自于HT4。正常状态下贴壁生长，普通DMEM培养基加上血清，双抗即可培养。该细胞系是体外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神经退化性疾病，例如Alzheimer's Disease和Parkinson's Disease中均有很好的应用。
HT22
HT22细胞培养操作[2-3]
1）复苏HT22细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）HT22细胞传代：如果HT22细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将HT22细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）HT22细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.HT22细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
HT22可以用于GDF11调控小鼠神经干细胞的生物学效应及机制研究
GDF11对神经干细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、细胞周期等生物学效应的作用,并从机制上进一步探索GDF11是如何发挥调控作用的。
方法1.利用PC12、C17.2和HT22三种神经干细胞系,通过CCK-8终点法、实时无标记动态监测法、细胞倍增法、流式细胞术、Calcein-AM/EthD-1双染、Hoechst/PI双染、Annexin V-FITC/PI双染、细胞划痕实验、western blot、qRT-PCR等细胞和分子生物学方法,系统分析GDF11对神经干细胞的增殖、凋亡、分化、迁移、细胞周期等的作用。
2. 通过蛋白质组学的方法研究GDF11干预后PC12神经干细胞蛋白质表达谱的变化,并通过生物信息学手段分析发生改变的关键蛋白质和信号通路;通过信号通路广筛芯片研究GDF11调控神经干细胞生物学效应主要富集的信号通路。
3. 通过western blot、qRT-PCR、流式细胞术、CCK8、细胞划痕、实时无标记动态监测等技术手段研究筛选到的信号通路在GDF11调控神经干细胞生物学效应的中的作用,并探究其机制。
结果1.CCK-8终点法、实时无标记动态监测法和细胞倍增法结果显示:在48 h内,GDF11对PC12、C17.2和HT22神经干细胞的的增殖的影响不大;在长期内(>70 h),高浓度的GDF11(50和100 ng/mL)显著抑制三种细胞的增殖。流式细胞和荧光显微镜结果发现GDFi1显著促进神经干细胞发生凋亡,有明显的剂量效应,并且显著下调细胞周期关键蛋白Cyclin D2和Cyclin B1,将细胞周期阻滞在G2/M期;细胞划痕研究表明GDF11可以减缓神经干细胞的伤口愈合;western blot和qRT-PCR发现GDF11处理后,神经干细胞的标记物nestin的蛋白质和mRNA水平降低,神经元标记物βⅢ-tubulin和星形胶质细胞标记物GFAP蛋白质和mRNA水平都明显增高。
2. TMT定量蛋白质组学研究显示,GDF11干预后,PC12神经干细胞有165个蛋白质表达发生变化(实验组/对照组>1.2或<0.83为变化阈值),其中实验组相对于对照组显著上调的蛋白质有90个,显著下调的蛋白质有65个。基因本论(Gene ontology,GO)富集分析发现差异蛋白质主要富集在磷脂酰肌醇磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号等方面。KEGG富集分析发现PI3K-Akt通路被显著富集。CSP100 PLUS信号通路广筛芯片发现GDF11作用于神经干细胞后,PI3K-Akt、细胞凋亡、细胞周期等信号通路变化明显。
3.GDF11处理PC12细胞后,Smad2/3和Akt的磷酸化水平显著升高,表明TGF-β/Smad2/3信号通路和PI3K-Akt信号通路被激活。当用SB431542抑制TGF-β受体ALK5后,GDF11诱导的Smad2/3和Akt磷酸化水平降低,并且GDF11抑制PC12细胞增殖和迁移、促进凋亡和分化、阻滞细胞周期等作用消失,表明GDF11依赖ALK5激活下游通路调控神经干细胞。用LY294002抑制PI3K后,GDF11诱导的Smad2/3磷酸化水平不变、但Akt磷酸化水平降低,此时GDF11抑制PC12细胞增殖和迁移、促进凋亡和分化、阻滞细胞周期等作用也被抑制,表明GDF11调控神经干细胞通过PI3K-Akt信号通路。
参考文献
[1]Luspatercept mitigates bone loss driven by myelodysplastic neoplasms and estrogen-deficiency in mice.[J].Weidner Heike;Wobus Manja;Hofbauer Lorenz C;Rauner Martina;Platzbecker Uwe.Leukemia,2022
[2]Old plasma dilution reduces human biological age:a clinical study.[J].Kim Daehwan;Kiprov Dobri D;Luellen Connor;Lieb Michael;Liu Chao;Watanabe Etsuko;Mei Xiaoyue;Cassaleto Kaitlin;Kramer Joel;Conboy Michael J;Conboy Irina M.GeroScience,2022
[3]Prevention of Ageing-The Role of Micro-Needling in Neck and Cleavage Rejuvenation:A Narrative Review.[J].Paj?k Justyna;Szepietowski Jacek C;Nowicka Danuta.International journal of environmental research and public health,2022(15)
[4]Growth differentiation factor 11 accelerates liver senescence through the inhibition of autophagy.[J].Sun Jian;Li Ying;Yang Xiao;Dong Wei;Yang Jiankun;Hu Qi;Zhang Cuntai;Fang Haoshu;Liu Anding.Aging cell,2021(1)
[5]王宗奎.GDF11调控小鼠神经干细胞的生物学效应及机制研究[D].北京协和医学院,2022.