背景[1-3]
蛋白酶K溶液不含DNase，不含RNase，可直接用于消化各种蛋白以及常见的分子生物学、细胞生物学等相关实验，例如基因组DNA抽提、酶的消化去除等。
蛋白酶K溶液浓度为50-100μg/mL，需根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。常用浓度的EDTA、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl、盐酸胍对蛋白酶K的活力影响不大。
酶活力:其含量30U/mg,在37℃以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1μM酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。有效的pH范围为pH4.0～12.5，适合pH范围为pH7.5～8.0。
蛋白酶K溶液
蛋白酶K的佳反应温度为65℃，大于65℃蛋白酶K会迅速地降解，一般采用反应50～55℃。在0.2～1%SDS或约10mM尿素存在的情况下，蛋白酶K显示更高的酶活性，常用工作浓度为0.05～1mg/ml。
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，具有高效的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所特有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca2+结合位点增加其稳定性，使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。
蛋白酶K在使用过程中的注意事项
（1）蛋白酶K的反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解，因此推荐反应温度50℃-55℃；
（2）Ca2+可以保护蛋白酶K不会自我降解、增加蛋白酶K的热稳定性、调节蛋白酶K的底物结合位点；
（3）配制好的蛋白酶K溶液分装保存于-20℃，避免反复冻融，以免酶活力下降；
应用[4-5]
蛋白酶K溶液可以用于外源蛋白酶K对生长后期草鱼生产性能、肠道消化吸收能力和肌肉品质的影响
研究了饲粮中添加蛋白酶K溶液对生长后期草鱼生产性能、肠道消化吸收能力和肌肉品质的影响,并依据不同标识确定了外源蛋白酶K在生长后期草鱼饲粮中的最适添加量。试验选取450尾健康草鱼(619.51±0.54 g),随机分为6组,3个重复/处理,25尾鱼/重复,分别饲喂外源蛋白酶K水平不同(0、3000、6000、9000、12000和15000 U/kg)的6种试验饲粮60天。
结果表明:饲粮中添加适宜水平外源蛋白酶K溶液能够提高生长后期草鱼的生产性能、氨基酸代谢和消化吸收能力:
(1)提高了采食量、增重百分比、特定生长率(P<0.05)、蛋白质效率比(P<0.08);
(2)提高了肝胰脏和肌肉谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶的活力(P<0.05),降低了血氨含量和肝胰脏谷氨酸脱氢酶的活力(P<0.05);
(3)提高了肠体指数、肠长指数、肠道皱襞高度和宽度、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、Na+/K+-ATP酶、肌酸激酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶活力(P<0.05);提高了血清中IIe、Leu和Thr等14种游离氨基酸的含量,降低了肠道中16种游离氨基酸的含量(P<0.05)。
进一步研究发现:饲粮中添加适宜水平外源蛋白酶K溶液能够提高生长后期草鱼前、中、后肠SLC7A7、SLC7A6、SLC1A3、SLC1A5、SLC6A14、SLC6A19b、SLC7A1、SLC7A5、SLC7A8、SLC7A9、SLC38A2、SLC6A6、TOR和S6K1的m RNA水平(P<0.05),下调4EBP1的m RNA水平(P<0.05),上调SLC1A5、SLC7A6、SLC1A3、T-TOR以及p-TORSer2448的蛋白表达(P<0.05)。
此外,饲粮中添加适宜水平外源蛋白酶K可改善生长后期草鱼的肌肉品质:
(1) 提高了草鱼肌肉的亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)、白度(W)、p H24h值和肌肉中UFA、C:18和亚油酸等脂肪酸含量(P<0.05);
(2) 降低了草鱼肌肉蒸煮损失、剪切力、乳酸和羟脯氨酸含量(P<0.05);
(3)增加了草鱼肌肉粗蛋白、粗脂肪和Val、IIe和Arg等12种游离氨基酸的含量(P<0.05)、降低了肌肉水分含量(P<0.05);
(4)上调了草鱼肌肉TOR和S6K1的m RNA水平(P<0.05),下调了4EBP1的m RNA水平,促进了p-TOR和p-S6K1的蛋白表达(P<0.05),下调了p-4EBP1的蛋白表达(P<0.05),并下调了蛋白质降解相关基因Ub、MAFbx、MURF1、FOXO1a和FOXO1b的m RNA水平与Ub的蛋白表达,上调了AKT的m RNA水平。
综上所述,饲粮中添加适宜水平的外源蛋白酶K可促进草鱼生产性能、消化吸收能力以及改善肌肉品质。适宜水平的外源蛋白酶K通过促进肠道生长发育、消化酶和刷状缘酶活性并上调氨基酸转运载体表达增强消化吸收能力;通过提高肌肉系水力、嫩度和风味脂肪酸含量改善肌肉品质;可能通过TOR途径促进肌肉蛋白质合成,并可能通过AKT/FOXO1信号途径抑制肌肉蛋白质降解从而促进肌肉蛋白质沉积。根据PWG、中肠碱性磷酸酶活性和肌肉粗蛋白含量,确定生长后期草鱼饲粮中外源蛋白酶K最适添加量分别为7380.82、7406.44和8590.42 U/kg。
参考文献
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