背景[1-3]
小鼠单核巨噬细胞是一种广泛用于研究骨骼疾病，如风湿性关节炎、骨质疏松症、骨质溶解和牙周炎等体外模型的细胞。
根据不同环境影响，巨噬细胞可极化为不同表型参与机体生理、病理反应。在体内外不同环境影响下，巨噬细胞可极化为不同表型参与机体生理、病理反应。从激活方式上分为经典激活的巨噬细胞M1和选择性激活的巨噬细胞M2。
M1型分化：细菌和脂多糖（LPS）可以诱导巨噬细胞向M1型分化，产生促炎细胞因子，抵抗病原入侵，但也会造成机体损伤。在实验中可采用2.5ng/mL IFN-γ和200ng/mL LPS共同作用12小时诱导其极化。
M2型分化：白细胞介素（IL-4）可以诱导巨噬细胞向M2型分化，分泌抗炎细胞因子，并在组织修复与重建和肿瘤的形成过程中发挥作用。在实验中可采用10ng/mL IL-4作用12小时诱导其极化。
小鼠单核巨噬细胞
小鼠单核巨噬细胞培养操作
1)复苏小鼠单核巨噬细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠单核巨噬细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠单核巨噬细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
小鼠单核巨噬细胞可以用于鞘氨醇-1-磷酸（S1P）对小鼠单核巨噬细胞炎性细胞因子表达和生成的影响
巨噬细胞是一类具有高度可塑性的免疫细胞群体,它们可以吞噬和清除侵入机体的病原体微生物,促进机体的炎症反应以及损伤组织的修复和重建。在生物体所处的特定微环境中,巨噬细胞可以极化出不同的表型,即经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞。通常在病原体感染的早期,巨噬细胞被激活极化成M1型巨噬细胞,然后产生大量的促炎介质,例如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮合酶(iNOS)等;同时也可以产生趋化因子,例如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、CCL2-4、CXCL8-11等。
鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是鞘磷脂代谢产生的一种生物活性脂类,广泛存在于血液和淋巴液中,S1P作为细胞外配体,与几乎存在于所有细胞种类的S1P膜受体结合,激活一系列下游信号通路产生重要生理功能,例如参与细胞增殖,细胞迁移,细胞凋亡,血管生成,和免疫反应等生物学作用。本实验以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7作为实验材料,探究了S1P对RAW264.7细胞相关细胞因子的基因表达和蛋白生成的影响。
首先,使用MTT法检测不同浓度的S1P对RAW264.7细胞增殖活性的影响,结果显示20500 nmol/L S1P处理RAW264.7细胞24 h,对RAW264.7细胞体外增值活性没有影响,并且在500 nmol/L浓度时细胞活性最强。
其次,探究RAW264.7细胞上S1P受体的表达情况,将巨噬细胞用LPS(1.0μg/mL)刺激极化成M1型巨噬细胞以后提取细胞总RNA,然后进行qRT-PCR检测,结果显示RAW264.7细胞表达S1PR1,S1PR2,S1PR4受体。
在探究S1P对LPS(1.0μg/mL)刺激的RAW264.7细胞极化成M1型巨噬细胞的影响中,使用500 nmol/L S1P处理M1型巨噬细胞之后,收集细胞并提取总RNA和蛋白质,运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)检测TNF-α、IL-6、MCP-1、iNOS、Arg-1和IL-10的基因表达情况,运用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TNF-α、IL-6、MCP-1、iNOS、Arg-1和IL-10的蛋白生成情况。
结果表明500 nmol/L S1P可以抑制RAW264.7细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1和iNOS的基因表达,降低它们蛋白的生成;并且可以增强抗炎细胞因子Arg-1和IL-10的基因表达和升高蛋白的合成。
由上述结果可以初步推论,一定浓度的S1P可以抑制M1型巨噬细胞的促炎因子的分泌,增强抗炎因子的分泌,因此S1P作为细胞外源物质具有一定的抗炎效果,而慢性疾病对人类健康的威胁不可小觑,很多慢性疾病大多与炎症有着不可分割的关系,这为缓解机体炎症以及一些慢性炎症疾病提供了新的研究思路。
参考文献
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[2]Macrophage plasticity,polarization,and function in health and disease.Abbas Shapouri‐Moghaddam;;Saeed Mohammadian;;Hossein Vazini;;Mahdi Taghadosi;;Seyed‐Alireza Esmaeili;;Fatemeh Mardani;;Bita Seifi;;Asadollah Mohammadi;;Jalil T.Afshari;;Amirhossein Sahebkar.Journal of Cellular Physiology,2018
[3]Sphingosine‐1‐phosphate receptors and innate immunity.Arielle M.Bryan;;Maurizio Del Poeta.Cellular Microbiology,2018
[4]The sphingosine 1-phosphate receptor modulator fingolimod as a therapeutic agent:Recent findings and new perspectives.Andrea Huwiler;;Uwe Zangemeister-Wittke.Pharmacology and Therapeutics,2018
[5]崔梦珂.鞘氨醇-1-磷酸（S1P）对小鼠单核巨噬细胞炎性细胞因子表达和生成的影响[D].河南师范大学,2020.