α-倒捻子素的应用与制备

2020/2/1 11:46:39

背景及概述[1]

α-倒捻子素是从植物山竹子中提取的一种氧杂蒽酮类化合物。此外,α-倒捻子素来源于天然山竹子的有效成分,具有安全无毒及悠久食用历史等特点,对α-倒捻子素作为药物的深入研究提供了理论和应用基础。目前,α-倒捻子素主要是从山竹子果壳中提取得到,但粗品中含有与其性质相近的β-倒捻子素、γ-倒捻子素等,通过单纯的重结晶方式,较难达到纯度很高的α-倒捻子素。工业方面,通过天然提取,重结晶等方式,能够得到纯度>70%、甚至>90%的α-倒捻子素,但成本高,而且无法得到满足医药原料药的高纯度α-倒捻子素(95%~99.9%)产品。

应用[2-5]

有文献报道α-倒捻子素具有抗老年痴呆、抗痢疾等药理作用,具有一定的药用应用价值。其应用举例如下:

1)α-倒捻子素可以缓解脂多糖(LPS)诱导的IEC-6细胞的炎症。

有研究在体外培养的IEC-6细胞中构建LPS诱导的炎症模型,并通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量PCR(Q-PCR)、蛋白印迹(Westernblot)的方法检测α-倒捻子素对LPS诱导的炎症是否有缓解作用。结果表明,5μmol·L-1的α-倒捻子素预处理可以显著降低LPS诱导的前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在IEC-6细胞中的分泌,以及环氧合酶2(COX-2)、IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的表达(P<0.05)。通过对炎症相关信号通路NF-κB的探究可见,α-倒捻子素能显著抑制Toll样受体4(TLR4)mRNA和NF-κB相关蛋白磷酸化IκBα(pIκBα)和磷酸化p65(pp65)的激活(P<0.05)。综上所述,α-倒捻子素可以通过TLR4/NF-κB信号通路来抑制LPS诱导的IEC-6细胞的炎症,并且可能是治疗炎症疾病的潜在选择。

2)α-倒捻子素(alpha-mangostin,α-MG)治疗对阿霉素诱导的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的肾脏保护作用。

采用模型后分为两组:

1)AN+生理盐水组,用生理盐水灌胃;2)AN+α-MG组,用α-MG(12.5mg/kg)灌胃。灌胃每日1次,从阿霉素注射当日开始。另取10只小鼠作为对照组。6周后处死小鼠,在光学显微镜下观察肾组织病理学改变;检测血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血胆固醇等肾功能相关生化指标水平;检测肾组织中超氧阴离子,丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性;检测血清中IL-1β,IL-18,IL-10,脂联素水平;用免疫组织化学、RT-PCR和Western印迹检测肾组织中TGF-β1,I型胶原蛋白(collagenI,ColI),α-SMA,沉默信息调控因子1(silentinformationregulator1,Sirt1),核苷酸结合结构域样受体蛋白3(NLRP3)水平。

结果:α-MG治疗可降低AN小鼠血肌酐、蛋白尿、尿蛋白/尿肌酐、血胆固醇,增加肌酐清除率、血浆白蛋白(P<0.05);缓解肾小球硬化和间质纤维化;下调纤维化指标ColI和α-SMA的表达(P<0.05);减少肾组织超氧阴离子的产生,降低MDA和GSH水平以及增加CAT和SOD活性(P<0.05);降低血清炎性因子IL-1β和IL-18水平,升高抗炎因子IL-10和脂联素水平(P<0.05);促进肾组织中Sirt1表达,抑制NLRP3的表达(P<0.05)。因此α-MG治疗能够改善阿霉素诱导的FSGS小鼠肾功能,延缓肾小球硬化和间质纤维化进程。α-MG通过促进肾脏Sirt1表达和抑制NLRP3表达而发挥抗炎和抗氧化作用。

3)α-倒捻子素对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响。

CCK8法检测α-倒捻子素对SGC7901细胞活力的影响,免疫荧光和流式细胞术检测α-倒捻子素对SGC7901细胞凋亡及细胞周期的影响,Westernblot法检测细胞凋亡及自噬相关蛋白的表达情况。统计分析的正态性检验采用Shapir-Wilk;服从正态分布的多组间比较采用单因素方差分析;方差不齐时,采用Welch矫正检验,两两间比较采用Games-Howell检验。结果CCK8法结果显示,不同浓度的α-倒捻子素(10、15、20、25、30μmol/L)处理后组间细胞活力的差异有统计学意义(P<0.05)。qPCR结果表明,LC3而非Caspase蛋白的mRNA水平与α-倒捻子素浓度呈正相关(r=0.976,P<0.05)。在15μmol/L而非10μmol/L的α-倒捻子素处理系统中,6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA,10μmol/L)、巴弗洛霉素A(10μmol/L)、LY294002(10μmol/L)等自噬抑制剂均能显著缓解α-倒捻子素对SGC7901细胞的杀伤作用(P<0.05)。因此α-倒捻子素可能主要通过诱导自噬性死亡而影响人胃癌细胞的活力。

4)α-倒捻子素对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响。

先分离培养人原代OA软骨细胞,分别给予5、10、20μmol/L的α-倒捻子素处理后24、48、72h运用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Westernblot法检测基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-3、MMP-13、过氧化物酶体增殖激活物受体γ(PPARγ)、PPARδ、过氧化物酶增殖激活受体γ共激活子-1α(PGC-1α)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅱ型胶原蛋白(collagen-Ⅱ)、蛋白多糖(proteoglycans,PG)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及IL-6含有量。

结果α-倒捻子素可显著促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;显著促进Collagen-Ⅱ和PG的产生;显著抑制MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达;显著促进PPARγ、PPARδ、PGC-1α的表达,抑制TNF-α的表达。此外,α-倒捻子素还可显著抑制IL-1β和IL-6的产生。结论α-倒捻子素可通过增加PPARδ、PPARγ的表达,促进OA软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡和炎性反应,从而延缓关节软骨的破坏和退变。

制备[1]

高纯度天然产物α-倒捻子素的合成工艺方法的合成路线如下所示:

1)上乙酰基:

称取α-倒捻子素粗品SM_1(纯度>70%)250g投入5L三口瓶中,在冰浴搅拌的条件下加入1L吡啶,慢慢滴加乙酸酐(1.25L),控制釜内温度在10度以下。滴毕,加热回流3h。浓缩过量的吡啶,向浓缩液中加1.2L二氯甲烷,有机相用5%的稀盐酸600mL×2洗两次,稀盐酸层用300mL×2二氯甲烷回萃,合并有机相。有机相用饱和食盐水300mL洗,无水硫酸钠干燥,旋干得棕色油状物326g,室温冷却后变为固体。粗品用二氯甲烷/石油醚=1/1重结晶两次,干燥,得淡黄色固体SM_2220g,收率为67.2%。

2)脱乙酰基:

称取三乙酰化的α-倒捻子素SM_2200g,加乙醇2L,搅拌。然后称取149.3g氢氧化钠配成2mol/L加到三口瓶中,加热回流,1h反应毕,用二氯甲烷洗水相(600mL×2)后,调酸,二氯甲烷萃取(600mL×2),浓缩,干燥,得150g粗品。将粗品150g,加600mL二氯甲烷使之全溶,活性碳脱色,过滤,浓缩,得黄色固体。二氯甲烷/石油醚=1/1重结晶三次得大量黄色固体析出,减压抽滤,干燥,得黄色固体96g,收率为57.1%。纯度>99.9%。

主要参考资料

[1] CN201410098847.8高纯度α-倒捻子素的合成工艺

[2] α-倒捻子素通过抑制TLR4/NF-κB信号通路缓解LPS诱导IEC-6细胞的炎症

[3] α-倒捻子素抑制阿霉素诱导的小鼠局灶节段性肾小球硬化

[4] α-倒捻子素通过加剧自噬影响胃癌细胞的增殖和凋亡

[5] α-倒捻子素调节骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡

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