蛋白酶K在核酸检测中的作用

2024/3/1 15:54:18 作者:云霄

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高的比活性,是DNA提取的关键试剂。本文将介绍其特性以及在核酸检测中的应用。

蛋白酶K

特性

根据蛋白酶K的蛋白结晶及分子结构学研究显示该酶属于枯草杆菌蛋白家族,活性位点具有特征性催化三联氨基酸Asp39-His69-Ser224,具有极高的酶活性和广泛的底物特异性,可去除RNA酶和DNA酶的活性,一般生物样品中通常用来降解蛋白质,可从林伯氏白色念球菌中纯化得到并以钙离子作保护剂。

该酶在较广的pH范围(4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)均有活性,用于质粒或基因组 DNA、RNA的分离。

在DNA提取中,主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白,使 DNA游离在溶液中,随后用不同方法进行抽提,除去杂质,收集DNA。

EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。蛋白酶K贮存液一般为10mg/ml或20mg/ml。贮存于-20°C。蛋白酶K溶液为无色透明,如出现沉淀就不能再使用。

核酸检测中的作用

新冠病毒的检测中,核酸扩增试验时的处理、提取、扩增是非常高风险的,因此扩增前需要先对标本进行病毒灭活,一般使用新冠核酸试剂组中自带的病毒采样液进行病毒灭活,其中的蛋白酶K是病毒保存液中一个非常重要的成分。

病毒保存液有两个作用:(1)非灭活型病毒保存液:直接裂解病毒释放核酸,消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。(2)灭活型病毒保存液:灭活病毒,让病毒的蛋白变性,使其失去活性而“死掉”,不再有传染性,提高运输和检测阶段的安全性。

蛋白酶K可降解与核酸紧密结合的组蛋白,分离DNA与蛋白质,使DNA能够更好被提取;另外,蛋白酶K可降解RNA水解酶(RNase)活性,抑制RNase水解模板的RNA,在RNA的提取和检测过程中起到不可或缺的作用,因此蛋白酶K在核酸检测中的意义十分重要。

存储

干粉状态可在0~4℃条件下低温保存;正确的储存条件下,干粉状态的有效期限可达二年。

溶解后分装为适当体积,于-20℃储存,运输可在室温下进行;液体状态在-20℃有效期限为半年。

打开包装使用后,如果在2~8℃环境下放置超过一周时间,建议过滤除菌或增加稳定剂如0.5%叠氮化钠,防止微生物污染。

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