背景及概述[1]
在生物体内，NTPs/dNTPs参与核酸的生物合成会生成副产物焦磷酸盐，体内存在的焦磷酸盐会在焦磷酸酶的催化作用下分解，减少焦磷酸累积可能造成的负面效应。PCR利用嗜热酶模拟体内核酸复制的体外反应，伴随dNTPs的参入，焦磷酸的累积同样会降低PCR扩增的效率。焦磷酸的积累，会导致反应混合物的pH降低，影响荧光染料的稳定性。
为了去除这些焦磷酸对PCR的抑制，人们在PCR反应中添加无机焦磷酸酶，用以将焦磷酸(PPi)会水解为正磷酸(Pi)。这种反应，会使反应混合液的pH增加，并是的荧光染料变得更稳定。为了适应PCR的高温，这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。重组表达了超嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii)的PPase基因，这种酶最适温度为88℃，最适pH为10.3，并不适合PCR的使用。重组表达了嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)HB27株的PPase基因。由此，基于嗜热栖热菌的PPase基因，构建一种改造的热稳定无机焦磷酸酶，这种酶可以应用于需要更多循环数以及反应时间的超敏PCR扩增，增加反应的扩增效率。热稳定无机焦磷酸酶特点：1）增强DNA复制2）100℃加热4小时，酶仍具有100%活性。热稳定无机焦磷酸酶来自重组E.coli菌株，携带从极度耐热的Thermococuslitoralis中克隆的无机焦磷酸酶基因。
制备[1]
热稳定无机焦磷酸酶，其序列为：
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIADVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRAAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：1)。
将上述酶的位点进行改造，改造位点及改造方法如下：将原酶的序列的第6位氨基酸T改造为氨基酸S；第11位氨基酸E改为氨基酸K；第72位氨基酸L改为氨基酸I或者第73位氨基酸V改为氨基酸I；第124位氨基酸D改造为氨基酸A；第160位氨基酸A改造为Q或K。获得两条氨基酸序列如下的热稳定焦磷酸酶：
无机焦磷酸酶1：
MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：2)。
无机焦磷酸酶2
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：3)。
按照上述焦磷酸酶的氨基酸序列人工合成对应的碱基序列，扩增构建表达载体，表达蛋白并进行纯化。
主要参考资料
[1] CN201710017276.4 一种改造的热稳定无机焦磷酸酶