背景[1-3]
MUSK抗体也被称为肌肉特异性酪氨酸激酶（Muscle-specific Kinase，简称MuSK）抗体，是一种针对MuSK蛋白的特异性抗体。MuSK是一种在骨骼肌中表达的跨膜蛋白，它参与突触分化和神经肌肉接头（NMJ）的维持机制。具体来说，MuSK蛋白在神经接头处形成，对乙酰胆碱受体（AChR）的聚集以及乙酰胆碱磷酸化起关键作用。
MUSK抗体的检测在医学上有重要意义，因为它被用于诊断一种特定的自身免疫性疾病——抗MuSK抗体阳性重症肌无力（MuSK MG）。这种疾病的特点是患者体内产生了针对MuSK蛋白的自身抗体，这些抗体会影响神经肌肉接头的正常功能，导致骨骼肌无力等症状。MuSK MG患者约占全部重症肌无力患者的5%～8%。
MUSK抗体
在结构上，MuSK蛋白由胞外结构域、跨膜区域和胞质结构域组成。其中，胞外结构包含3个Ig样结构域和1个富含半胱氨酸的结构域（也称为frizzled样结构域）。而胞质结构域则由短的近膜区、酪氨酸激酶结构域以及1个含有8个氨基酸的羧基端序列组成。
在功能上，MuSK蛋白和MuSK抗体在神经肌肉传递中起着重要作用。MuSK蛋白参与AChR的聚集和维持NMJ功能完整，而MuSK抗体则可能影响这一过程，导致神经肌肉传递障碍。此外，免疫球蛋白样1和2区介导的agrain-Lrp4-MuSK信号以及半胱氨酸富集区介导的Wnt-MusK-Dishevelled信号都参与了乙酰胆碱受体簇集过程。
应用[4][5]
MUSK抗体可以用于PTPRR调节MuSK去磷酸化抑制乙酰胆碱受体富集的相关研究
寻找可以使肌肉特异性受体型酪氨酸激酶(Muscle,skeletal receptor tyrosine-protein kinase,MuSK)去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,探究MuSK的酪氨酸磷酸化位点及受该酪氨酸磷酸酶调节的酪氨酸位点,探讨该酪氨酸磷酸酶通过使MuSK去磷酸化对乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)富集的调节作用,拓展MG病因研究,并为治疗提供新的靶点及思路。
研究方法:用10种酪氨酸磷酸酶质粒与MuSK质粒共转染HEK293细胞,通过MUSK抗体蛋白质免疫印迹及免疫沉淀技术筛选出可使MuSK去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,免疫共沉淀检测该酪氨酸磷酸酶是否能与MuSK形成蛋白复合物;Flag-MuSK质粒转染HEK293细胞,Flag-Beads富集、纯化MuSK蛋白后行聚丙烯酰氨凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并回收MuSK蛋白,行质谱分析以检测MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化位点;根据质谱结果,运用点突变技术构建单/多位点突变的MuSK质粒,突变质粒与筛选出的酪氨酸磷酸酶质粒共转染HEK293细胞,进行蛋白质免疫印迹确定该酪氨酸磷酸酶使MuSK去磷酸化的酪氨酸位点;利用慢病毒包装技术,构建该酪氨酸磷酸酶野生型/突变型过表达的C2C12细胞系,C2C12细胞长至90%后更换为分化培养基以诱导细胞融合并分化成肌管细胞,用Agrin刺激细胞24h诱导AChR在细胞膜富集,4%甲醇固定并用1 mM的AlexaFluor 555-conjugated alphabungarotoxin标记AChR 24小时,激光共聚焦荧光显微镜下观测荧光标记的肌管细胞,统计AChR富集的数量及长度。通过比较野生型C2C12、野生型酪氨酸磷酸酶高表达C2C12、突变型酪氨酸磷酸酶高表达C2C12的AChR富集,探究酪氨酸磷酸酶对AChR富集的调节作用。
MUSK抗体研究结果:经过筛选发现,酪氨酸磷酸酶PTPRR可使MuSK显著去磷酸化,免疫共沉淀显示PTPRR可与MuSK形成蛋白复合物;质谱分析表明MuSK蛋白的Y553、Y750、Y754、Y755四个位点的酪氨酸残基可被磷酸化修饰,PTPRR可使其中的Y754位点去磷酸化;经统计表明,高表达野生型PTPRR的C2C12肌管细胞相较于野生型C2C12细胞AChR富集的数量减少、长度变短,而高表达D554A突变型PTPRR的C2C12细胞较于野生型C2C12细胞AChR富集的数量增多、长度变长(数据来源于3次以上实验,每组肌管数量≥45,unpaired t test,P<0.05)。
参考文献
[1]The overexpression of Fra1 disorders the inflammatory cytokine secretion by mTEC of myasthenia gravis thymus[J].Q.‐R.Li;;W.‐P.Ni;;N.‐J.Lei;;J.‐Y.Yang;;X.‐Y.Xuan;;P.‐P.Liu;;G.‐M.Gong;;F.Yan;;Y.‐S.Feng;;R.Zhao;;Y.Du.Scandinavian Journal of Immunology,2018(1)
[2]Toll‐like receptors 7 and 9 in myasthenia gravis thymus:amplifiers of autoimmunity?[J].Paola Cavalcante;;Claudia Barzago;;Fulvio Baggi;;Carlo Antozzi;;Lorenzo Maggi;;Renato Mantegazza;;Pia Bernasconi.Annals of the New York Academy of Sciences,2018(1)
[3]Stat3 Signaling Promotes Survival And Maintenance Of Medullary Thymic Epithelial Cells[J].Dakshayani Lomada;;Manju Jain;;Michelle Bolner;;Kaitlin A.G.Reeh;;Rhea Kang;;Madhava C.Reddy;;John DiGiovanni;;Ellen R.Richie.PLOS Genetics,2016(1)
[4]Myasthenia gravis:subgroup classification and therapeutic strategies[J].Nils Erik Gilhus;;Jan J Verschuuren.The Lancet Neurology,2015
[5]陈言勋.PTPRR调节MuSK去磷酸化抑制乙酰胆碱受体富集的相关研究[D].福建医科大学,2020.