背景[1-3]
小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗小鼠骨粘连蛋白(ON)抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入小鼠骨粘连蛋白(ON)校准品和待测样本，再加入生物素标记抗体，经过温育与充分洗涤后，再加入HRP偶联的亲和素，经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加显色液TMB，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中小鼠骨粘连蛋白(ON)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中小鼠骨粘连蛋白(ON)的浓度。
小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒
小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒样品的准备和保存：
细胞培养上清—离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清—用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆—采用肝素、柠檬酸盐或EDTA抗凝，抽血后30分钟内在2-8℃离心2000×g 20分钟。为消除血小板的影响，建议在2-8℃进一步离心10000×g 10分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞裂解液—对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000—14000×g离心3-5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
尿液—用无菌管收集，离心2000×g 20分钟。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒操作程序：
1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
2、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本稀释液孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。
4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
5、除空白孔外，每孔加入HRP标记亲和素100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。
6、重复步骤4。
7、所有孔中加入底物显色液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。
8、所有孔加入终止液50μL，在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
应用[4][5]
小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒可以用于26-nor-8-羟基-α-芒柄花醇对成骨细胞活性影响的实验研究
研究拟以玉柏石松中分离出的一种新型化合物四环三萜26-nor-8-羟基-α-芒柄花醇(26-nor-8-hydroxy-α-onocerin,简称26HO)为对象,研究其对体外培养的成骨细胞分裂增殖和成骨相关基因表达的影响,以期阐明其是否为治疗骨折的有效成分及其治疗骨损伤的分子机制。本文研究了26HO对体外培养的成骨细胞的细胞增殖、碱性磷酸酶的活性、及成骨相关基因(碱性磷酸酶ALP、骨涎蛋白BSP、I型胶原Col I、骨钙蛋白OC、骨粘连蛋白ON、骨桥蛋白OP、转录相关因子Runx2和Osterix)表达的影响。用组织块改良法分离小鼠颅盖骨成骨细胞。分离培养的细胞形态正常,表现出较强的活性,经鉴定为成骨细胞。MTT及小鼠骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒实验结果表明:较高浓度(20μM/L,40μM/L)26HO短期(1天)处理可以促进成骨细胞增殖。长期(3天)处理对成骨细胞增殖没有显著影响。研究表明,26HO处理可以影响原代成骨细胞的碱性磷酸酶活性。总体来讲,随着培养时间的延长(从3天至14天),低浓度的26HO(5μM/L)由促进成骨细胞碱性磷酸酶活性逐步变为抑制作用;高浓度(20-40μM/L)26HO则由抑制成骨细胞碱性磷酸酶活性逐步变为促进作用。实时定量PCR的结果显示,26HO短期处理(3天)会抑制成骨细胞osterix和Runx-2的表达;总体来讲,26HO不利于BMP-2和BSP的表达,对很多其他骨相关基因表达则呈现出复杂性。
参考文献
[1]Tenuigenin treatment decreases secretion of the Alzheimer’s disease amyloidβ-protein in cultured cells[J].Hongxiao Jia;;Yong Jiang;;Yan Ruan;;Yanbo Zhang;;Xin Ma;;Jizhi Zhang;;Konrad Beyreuther;;Penfei Tu;;Dai Zhang.Neuroscience Letters,2004(1)
[2]Jezananals A and B:two novel skeletal triterpene aldehydes from the stem bark of Picea jezoensis var.jezoensis[J].Reiko Tanaka;;Kazuhiro Tsujimoto;;Yasuko In;;Toshimasa Ishida;;Shunyo Matsunaga;;Harukuni Tokuda;;Osamu Muraoka.Tetrahedron,2002(13)
[3]Osteoblast-like Cell Cultures from Human Stapes[J].Philipp Dost;;Wouter-J.F.Ten Cate;;Martin Wiemann.Acta Oto-Laryngologica,2002(8)
[4]Triterpene Constituents from the Stem Bark of Pinus luchuensis and their DNA Topoisomerase II Inhibitory Effect[J].Shun-ichi Wada;;Akira Iida;;Reiko Tanaka.Planta Med,2001(07)
[5]李俊.26-nor-8-羟基-α-芒柄花醇对成骨细胞活性影响的实验研究[D].中南民族大学,2011.