背景[1-3]
小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠促卵泡素(FSH)水平。用纯化的小鼠促卵泡素(FSH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入抑瘤素M(OSM)，再与HRP标记的抑瘤素M(OSM)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抑瘤素M(OSM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠促卵泡素(FSH)浓度。
小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒
小鼠促卵泡素(FSH)Elisa试剂盒检测前准备工作：
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃
3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
小鼠促卵泡素(FSH)Elisa试剂盒样本处理及要求：
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。
7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
小鼠促卵泡素(FSH)Elisa试剂盒操作步骤：
1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
小鼠促卵泡素(FSH)Elisa试剂盒实验结果计算：
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒可以用于长效重组促卵泡素支持高质量的小鼠卵泡体外发育和卵母细胞体外成熟
研究中提出了一种具有较长半衰期的新型重组FSH(KN015)作为经典FSH的替代品。KN015在小鼠卵泡二维体外培养的过程中支持初级卵泡到排卵前卵泡的发育,效率高于普通的FSH(果纳芬),并且提高卵母细胞的受精后发育率。KN015的使用让我们可以比较卵母细胞和颗粒细胞在体内和体外不同阶段的动态转录组变化。KN015促进了mRNA在生长的卵母细胞中的积累,并在体外阻止了颗粒细胞的自发黄素化。这项研究中对转录组变化的分析表明,体内卵母细胞在成熟过程中母源mRNA的降解效率比体外卵母细胞高。KN015促进卵母细胞体外成熟过程中母源mRNA的降解,促进卵母细胞细胞质成熟,提高胚胎的发育潜力。这些发现建立了卵母细胞和颗粒细胞在卵泡发育的关键阶段的新转录组数据,可能有助于KN015成为一种有效的和可商用的激素,从而能够在体外卵泡和卵母细胞发育中进行优化。
探究新型重组FSH(KN015)是否比普通FSH更能支持卵泡体外培养和卵母细胞体外成熟,及其作用机制。研究方法:通过转录组分析体内体外各级卵泡的卵母细胞及颗粒细胞的基因表达情况,qPCR验证卵母细胞及颗粒细胞相关基因mRNA的表达水平,免疫荧光分析卵母细胞细胞核以及纺锤体的形态。研究内容:1.不同卵泡刺激素处理下体外培养卵泡成熟率以及卵母细胞成熟的定量和鉴定,及使用小鼠促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒探究卵泡体外培养合适的FSH浓度。2.比较卵母细胞和颗粒细胞在体内和体外不同阶段的转录组变化。3.不同卵泡刺激素处理下体外培养完全生长的卵母细胞成熟情况以及卵母细胞和卵丘细胞的基因表达情况。
参考文献
[1]Anti-Müllerian Hormone in Pathogenesis,Diagnostic and Treatment of PCOS[J].Rudnicka Ewa;Kunicki Micha?;CalikKsepka Anna;Suchta Katarzyna;Duszewska Anna;Smolarczyk Katarzyna;Smolarczyk Roman.International Journal of Molecular Sciences,2021(22)
[2]CNOT6/6L-mediated mRNA degradation in ovarian granulosa cells is a key mechanism of gonadotropin-triggered follicle development.[J].Dai XingXing;Jiang ZhiYan;Wu YunWen;Sha QianQian;Liu Yang;Ding JiaYi;Xi WenDong;Li Jing;Fan HengYu.Cell reports.2021
[3]Biallelic variants in ZFP36L2 cause female infertility characterised by recurrent preimplantation embryo arrest.[J].Zheng Wei;Sha QianQian;Hu Huiling;Meng Fei;Zhou Qinwei;Chen Xueqin;Zhang Shuoping;Gu Yifan;Yan Xian;Zhao Lei;Zong Yurong;Hu Liang;Gong Fei;Lu Guangxiu;Fan HengYu;Lin Ge.Journal of medical genetics.2021
[4]Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum‐free culture of secondary follicles in vitro[J].Li Ang;Wang HuaiXiu;Wang Feng;Fan LiHua;Zhao ZhengHui;Han Feng;Li Jian;Lei WenLong;Zhou Qian;Shi YaPing;Song ChunYing;Schatten Heide;Sun QingYuan;Guo XingPing.Journal of Cellular Physiology.2021
[5]李妍楚.长效重组促卵泡素支持高质量的小鼠卵泡体外发育和卵母细胞体外成熟[D].南方医科大学,2022.