背景[1-3]
HUNK抗体是一种可以特异性结合HUNK的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的HUNK蛋白。HUNK抗体与多种技术兼容，包括免疫印迹(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫荧光(IF)、石蜡包埋切片免疫组化(IHCP)、流式细胞术(FCM)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。HUNK，即荷尔蒙上调神经激酶，在调节细胞增殖和存活，特别是在癌症发展过程中起着至关重要的作用。HUNK在信号通路中的参与使其成为了解肿瘤发生和开发治疗策略的重要目标。研究HUNK对于阐明激素诱导细胞反应的机制及其对各种疾病的影响至关重要。
HUNK抗体
HUNK抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（HUNK抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(HUNK抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
HUNK抗体可以用于HUNK抑制结肠癌上皮间质转化的功能及机制研究
研究聚焦于HUNK在结肠癌中发挥的分子功能和机制。
方法:(1)针对HUNK对EMT的抑制作用:(1)构建HUNK敲除细胞系:设计2-3条靶向HUNK基因的sg RNA,构建到sg RNA与Cas9蛋白的共同表达载体,使用电转技术将表达载体转染SW480细胞系,筛选转染成功的阳性细胞,提取基因组DNA,并通过对第一外显子进行PCR,对产物测序进行测序,对比HUNK基因片段,检测其是否存在缺失突变,并通过HUNK抗体western验证敲除是否成功;
(2) 构建HUNK过表达及敲减细胞系:设计针对HUNK基因全长编码区的引物,将HUNK全长基因通过PCR扩增,构建HUNK过表达载体,通过HEK293T细胞包装相应的慢病毒,过表达的慢病毒感染结肠癌SW480细胞及RKO细胞。针对HUNK基因设计si RNA,通过瞬时转染方法,对结肠癌SW480细胞及RKO细胞的HUNK进行敲减;
(3) HUNK对EMT的作用研究:对HUNK敲除细胞系在光学显微镜下进行形态观察;对HUNK敲减、敲除和过表达细胞系与各自的对照细胞系进行transwell迁移及侵袭实验;培养上述细胞,通过HUNK抗体western技术分别检测EMT的标志分子E-cadherin和Vimentin等蛋白的表达量。同时对培养的细胞通过CTG试剂盒对细胞5天增殖能力评估。
HUNK介导结肠癌EMT的信号通路:(1)HUNK敲除细胞系与野生型细胞系高通量转录组测序,测序完成后,将测序reads进行比对,进行基因组注释,定量转录本丰度,对表达量低的基因进行过滤,并对reads count进行标准化处理,构建表达矩阵。使用GSEA软件对表达矩阵进行分析,对敲除HUNK的细胞系与对照细胞系的差异基因进行GSEA通路富集;(2)探索HUNK结合蛋白:在SW480细胞系中过表达FLAG标签偶联的HUNK-FLAG质粒,裂解过表达细胞,通过FLAG磁珠对HUNK-FLAG蛋白及其结合蛋白进行免疫共沉淀,使用LC/MS进行蛋白质谱检测,通过蛋白数据库匹配分析找出HUNK潜在的结合蛋白,并通过免疫共沉淀与HUNK抗体western验证相互结合作用。
参考文献
[1]Parsingβ-catenin's cell adhesion and Wnt signaling functions in malignant mammary tumor progression.[J].Buechel David;Sugiyama Nami;Rubinstein Natalia;Saxena Meera;Kalathur Ravi K R;Lü?nd Fabiana;Vafaizadeh Vida;Valenta Tomas;Hausmann George;CantùClaudio;Basler Konrad;Christofori Gerhard.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2021(34)
[2]Global colorectal cancer burden in 2020 and projections to 2040.[J].Xi Yue;Xu Pengfei.Translational oncology.2021
[3]Effective Predictor of Colorectal Cancer Survival Based on Exclusive Expression Pattern Among Different Immune Cell Infiltration[J].Xu Xiaowen;Ma Jun;Yu Guanyu;Qiu Qun;Zhang Wei;Cao Fuao.Journal of Histochemistry&Cytochemistry.2021
[4]Hypoxia-induced epithelial to mesenchymal transition in cancer[J].Robert Y.Hapke;;Scott M.Haake.Cancer Letters.2020
[5]韩晓琦.HUNK抑制结肠癌上皮间质转化的功能及机制研究[D].贵州大学,2022.