背景技术
黄体酮(progesterone)又称孕酮、黄体激素。绝大部分黄体酮由卵巢内的黄体分泌，其可以保护女性的子宫内膜，在女性怀孕期间，给胎儿的早期生长及发育提供支持和保障。在黄体酮的衍生化类型中，11ALPHA-孕酮是一种具有类似于黄体酮性质的甾体激素。它在女性体内调节生殖周期、妊娠和乳腺发育等生理过程，并且参与调节女性的月经周期和促进子宫内膜的增生。此外，11ALPHA-孕酮也在临床上用作激素药物。它可以用于治疗多种妇科疾病，如月经失调、不孕症等，并且用于辅助生殖技术中，帮助促进卵巢功能和增加受孕成功的机会。11ALPHA-孕酮还是许多种甾体激素合成的中间体，11ALPHA-孕酮凭借其分子结构优势可逐渐成为皮质激素市场的重要原材料，该应用方向也为黄体酮拓宽了多元化的下游市场需求来源。
羟基化转化过程中，基本都是由P450酶催化的，其一般存在于细菌及真核细胞的内质网及线粒体。羟基化的过程是通过单加氧酶把氧气中的氧原子直接添加到甾体母核上。甾体母核的羟基化是重要的微生物转化甾体反应类型，通过11位羟基化在母核上加入羟基能显著增强药物作用。目前工业化羟基化主要使用的菌种为黑根霉与赭曲霉，其转化黄体酮的时间较长，且转化率低。为此需要一种转化时间短，转化率高的黄体酮转化生产11ALPHA-孕酮的方法。
制备方法
S1，产孢：以曲霉Aspergillus nakazawae(CBS 640.78)为生产菌株，将该菌置于PDA培养基上，30℃恒温培养5d生成黄色孢子。将制得的产孢培养基放于4℃冰箱保藏。
S2，孢子悬液制备：将100mL生理盐水加入到产孢培养基中，清洗孢子，制得孢子悬液。
S3，种子培养，用无菌铲铲取孢子悬液，按10v/v％的接种量接入种子摇瓶培养基(500mL/1000mL三角瓶)，30℃，220rpm，培养24h即得发酵种子。种子培养基组分为葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氢二铵0.05g/L和玉米浆干粉8g/L，pH调至6，121℃灭菌30min。
S4，发酵转化，将种子培养液按5v/v％的接种量接种到发酵培养基中，发酵初始转速200rpm，通气量10L/h，培养温度29℃。培养16h，投入终浓度20g/L黄体酮，通气量升至20L/h。发酵培养基组分为玉米浆干粉6g/L、葡萄糖45g/L、吐温‑80 1g/L、泡敌0.2g/L、硫酸铵0.08g/L、钼酸钠0.06g/L，121℃灭菌30min，灭菌前pH调至6.2，灭菌后pH调至6.0。
S5，营养补加：发酵24h后，发酵液中的初始葡萄糖趋于耗尽时，开始以100mL/h的流速流加150g/L的葡萄糖溶液，当高效液相色谱检测的发酵液中的黄体酮转化率高于95.00％时结束发酵，记录此时的转化率。
S6，收集黄体酮发酵液，用抽滤装置将液体滤去得到菌饼，将菌饼与10倍量甲醇(m/v)一起投入反应釜中萃取1h，之后用抽滤装置将菌饼与萃取液分离，重复一遍萃取过程。收集两次萃取液用真空旋蒸装置40℃回收甲醇，得到11ALPHA-孕酮粗提产物。
S7，将粗提产物与5倍量二氯甲烷(m/v)混合，并加入0.1倍质量活性炭(m/m)脱色， 37℃下处理2h后，抽滤除活性炭得到一次精制产物。再加入5倍量甲苯(m/v)，70℃蒸馏回收二氯甲烷，然后过滤得到精制产物，检测精制产物11ALPHA-孕酮的纯度。
参考文献
[1]湖北共同甾体药物研究院有限公司. 一种黄体酮高效发酵转化生产11α-羟基黄体酮的方法:CN202410497818.2[P]. 2024-06-28.