介绍
1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanedimethylamine,1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体，被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。外观为无色至淡黄色液体，具有胺类特有的刺激性气味。其分子中含两个氨基，呈碱性，可与酸反应生成盐；易溶于水、乙醇、乙醚等极性溶剂，难溶于非极性有机溶剂。
图一 1,4-环己烷二甲胺
合成
现有合成的缺点
目前主要采用化学法合成1,4-环己烷二甲胺，主要包括苯二甲腈法和环己烷二甲醇氨化法。苯二甲腈法以苯二甲腈为原料经过两步加氢反应制得环己烷二甲胺，虽然技术较为成熟、产能占据绝对优势，但是反应条件苛刻、设备投资大、操作安全要求高且后续分离精制收率低。环己烷二甲醇氨化法以环己烷二甲醇为原料通过临氢氨化反应制备环己烷二甲胺，虽然生产效率高，但不可避免地会伴生约6%的仲胺和高聚物副产物，分离成本高，微量的杂质对下游的聚合等应用也会造成严重影响，此外反应过程中需要的季铵碱助剂四甲基氢氧化铵为剧毒，有一定安全生产的风险。因此，需要寻找更安全、环保的合成方法替代。
新合成方法
通过利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的转氨酶(transaminase,Ec TA)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,Sc Glu-DH)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,Cb FDH)构建了催化1,4-环己烷二甲醛生产1,4-环己烷二甲胺的双菌三酶级联路径。通过转氨酶的蛋白质工程改造、共表达菌株的构建和反应体系的优化提高级联路径的催化效率，从而提高产量和摩尔转化率。
将96孔板离心收集菌体，用于随后的全细胞催化反应，30℃反应24 h后离心取上清。取上清液与茚三酮溶液各加100μL至酶标条中，40℃反应10 min。根据反应所生成物质的蓝紫色深浅，在570 nm波长下进行比色就可以测定产物的相对含量(在一定浓度范围内，显色溶液的吸光度与1,4-环己烷二甲胺的含量成正比)。
高效液相色谱HPLC法测定1,4-环己烷二甲胺：使用邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生反相HPLC[8-9]来测定转化液中产物1,4-环己烷二甲胺的产量。使用戴安高效液相色谱仪：Agilent ZORBAX SB-aq色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)，流动相A:0.01 mol/L KH2PO4,KOH调pH至5.3，有机膜抽滤后超声脱气15 min；流动相B为流动相A、乙腈、甲醇按体积比1:5:3进行混合，用醋酸调p H至5.3。采用表3所示的梯度洗脱程序进行洗脱；柱温35℃，流速1 m L/min，进样量为10μL，色谱保留时间23 min，检测波长为338 nm。1,4-环己烷二甲醛在转氨酶催化下，以谷氨酸为氨基供体合成1,4-环己烷二甲胺。为了促进谷氨酸的再生，引入NADH依赖的谷氨酸脱氢酶，以游离的铵根离子为供体，将α-酮戊二酸还原为谷氨酸；此外，引入甲酸脱氢酶用以构建NADH循环。
有研究发现苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)和E.coli来源的转氨酶对己二醛有催化活性。本研究的底物是1,4-环己烷二甲醛，与己二醛的结构类似，因此选取这3种转氨酶用于后续研究。将3种酶基因克隆表达于E.coli BL21中，构建获得重组菌株BL21-Sm TA、BL21-Rp TA和BL21-Ec TA。摇瓶发酵14 h收集湿菌体冷冻干燥，测定不同来源的转氨酶催化1,4-环己烷二甲醛生成1,4-环己烷二甲胺的产量。BL21-Sm TA、BL21-Rp TA和BL21-Ec TA的冻干细胞催化生成1,4-环己烷二甲胺的产量分别为(0.77±0.08)、(0.02±0.01)和(3.01±0.11) g/L，因此选择BL21-Ec TA用于转氨反应。为了使得谷氨酸再生，偶联来源于S.cerevisiae的谷氨酸脱氢酶(S.cerevisiae glutamate dehydrogenase,Sc Glu-DH)将α-酮戊二酸高效转化为谷氨酸并偶联具有广泛工业应用潜力的C.boidinii来源的甲酸脱氢酶(C.boidinii formate dehydrogenase,Cb FDH)来构建NADH循环[1]。
图二 1,4-环己烷二甲胺的酶法合成路径
参考文献
[1]韩业挺,何志震,魏婉清,等.酶法生产1,4-环己烷二甲胺[J].生物工程学报,2024,40(06):1882-1894.DOI:10.13345/j.cjb.230606.