背景[1-3]
NRK-52E(大鼠肾细胞)是从大鼠肾近曲小管分离出来的具有上皮形态的细胞系，为自发永生化细胞。NRK-52E是常用的肾脏细胞模型，有助于揭示肾脏疾病（如肾纤维化、钠代谢紊乱、糖尿病等）的发展机制，以及评估药物的肾脏毒性，对开发新的治疗策略和药物安全性评价具有重要意义。
NRK-52E(大鼠肾细胞)
NRK-52E(大鼠肾细胞)培养操作步骤
1.细胞复苏：
(1)将冻存管从液氮中取出，快速放入37°C水浴锅中，轻摇冻存管使之溶解；
(2)溶解后把细胞悬液转移到含有5 ml培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000 rpm离心3 min，弃上清；
(3)加入新鲜的完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液接种到含6-8 ml完全培养基的培养瓶中轻轻吹打混匀，37°
C、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2.细胞传代（以T25瓶为例）：
（1）贴壁细胞
细胞汇合度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
a.吸出原培养液；
b.加入3 ml左右不含钙、镁离子的PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃；
c.加入1 ml左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；
d.置于37°C培养箱消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），显微镜下看到细胞明显变圆，有间隙时可终止，全程不要拍打培养瓶；
e.加入3 ml含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀后吸出，细胞尽量呈单细胞悬液；
f.将细胞悬液转移至离心管中，室温1000 rpm离心3分钟，弃去上清液；
g.加入2 ml新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可。首次传代将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8 ml新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:3~1:4的比例进行。
（2）悬浮细胞
悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。一般情况下细胞密度维持在1×105~1×106个/ml（不同细胞对密度要求不同），首次传代将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8 ml新鲜的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:4的比例进行。
3.细胞冻存：
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；
(1)细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中1000 rpm离心3-5 min，弃去上清；
(2)加入细胞冻存液（30%基础培养基+60%FBS+10%DMSO）重悬细胞，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml，将悬液加入到冻存管中；
(3)将冻存管放入梯度冻存盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中长期保存。
应用[4][5]
NRK-52E(大鼠肾细胞)可以用于基于高尿酸诱导的NRK-52E细胞模型探讨ZAG对EMT标志物和MAPK信号通路相关分子的影响
探索高尿酸环境诱导下的NRK-52E(大鼠肾细胞)中锌α2糖蛋白(zinc-α2-glycoprotein,ZAG)对上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)标志物以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路相关分子的影响,为高尿酸血症肾病的分子机制提供新的思路。
方法:将NRK-52E(大鼠肾细胞)分为正常对照组和高尿酸诱导组(20mg/d L浓度尿酸刺激48h),每组中的细胞都分别进行ZAG的过表达转染和敲低,观察细胞中ZAG的表达水平对EMT标志物和MAPK信号通路相关分子的影响。
结果:在高尿酸干预后NRK-52E中ZAG mRNA和蛋白质表达量明显升高(P<0.01;P<0.0001);相较于正常培养组,高尿酸环境培养下的NRK-52E(大鼠肾细胞)中EMT标志物波形蛋白(vimentin)和层粘连蛋白(laminin)mRNA及蛋白质的表达均升高(P<0.05);在高尿酸环境培养下,上调ZAG会减少大鼠肾细胞在MAPK通路中MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(Extracellularsignal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen activated protein kinase,p38-MAPK)、活化转录因子2(activated transcription factor-2,ATF2)及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or Akt)mRNA的表达量(P<0.01),而ZAG的下调则会增加上述基因的表达量(P<0.05)。在NRK-52E(大鼠肾细胞)蛋白质层面上,相较于未转染组,ZAG上调组的MAPK、p38和Akt表达量降低(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);ZAG下调组的ERK1/2、p38和Akt表达量升高(P<0.0001、P<0.05、P<0.01)。
参考文献
[1]Estradiol Ameliorates Acute Kidney Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting the TGF-βRI-SMAD Pathway[J].Ren Lian;Li Fang;Di Ziyang;Xiong Yan;Zhang Shichen;Ma Qing;Bian Xiaoen;Lang Zhiquan;Ye Qifa;Wang Yanfeng.Frontiers in Immunology.2022
[2]Association between Serum Uric Acid and Impaired Endothelial Function:The Circulatory Risk in Communities Study.[J].Tang Jingyun;Liu Keyang;Eshak Ehab S;Cui Renzhe;Sakaniwa Ryoto;Imano Hironori;Dong JiaYi;Iso Hiroyasu.Journal of atherosclerosis and thrombosis.2021
[3]Molecular Biological and Clinical Understanding of the Pathophysiology and Treatments of Hyperuricemia and Its Association with Metabolic Syndrome,Cardiovascular Diseases and Chronic Kidney Disease[J].Yanai Hidekatsu;Adachi Hiroki;Hakoshima Mariko;Katsuyama Hisayuki.International Journal of Molecular Sciences.2021
[4]Study of Endothelial Dysfunction by Flow Mediated Vasodilation in Individuals with Asymptomatic Hyperuricemia.[J].Shukla Vaibhav;Fatima Jalees;Varshney Ankit Raj;Joshi Prerit;Kugashiya Ruman.The Journal of the Association of Physicians of India.2021
[5]陈柄源.基于高尿酸诱导的NRK-52E细胞模型探讨ZAG对EMT标志物和MAPK信号通路相关分子的影响[D].右江民族医学院,2024.