DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)是一种能够与DNA中大部分A,T碱基相互结合的荧光染料。高浓度的DAPI可以穿透细胞膜,用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI染色液常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测显蓝色。此外,DAPI具有很高的光漂白承受水平,能用来检测酵母线粒体DNA,叶绿体DNA,病毒DNA,Microplasm DNA以及染色体DNA。
检测原理
DAPI可以和双链DNA富含AT序列的小沟结合,产生比自身强20多倍的蓝色荧光。DAPI也可对RNA进行染色,染色机理是其可以选择性嵌入“AU序列”并发出荧光。相比DAPI-dsDNA(Ex/Em=358 nm/461 nm),DAPI-RNA具有较长的最大发射波长(500 nm),其荧光亮度仅有DAPI-dsDNA的20%。
使用方法
(1)DAPI储存液及工作液的配置
储存液的配置 :DAPI分子量为350.25,配置5mg/mL(约14mM)的母液:用1mL无菌水将5mg DAPI完全溶解后分装,-20℃冻存。
工作液的配置:使用1×PBS或培养基将恢复到室温且完全融化的DAPI储存液稀释为5 μg/mL(约14 μM)的工作液(1:1000)。
注意:工作液建议现用现配,可于4℃暂存,当天使用完。
(2)染色操作
对于细胞或组织样品,固定后,适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色,则先进行免疫荧光染色,染色完毕后再按后续步骤进行DAPI 染色。如果不需要进行其它染色,则直接进行后续的DAPI 染色。
对于贴壁细胞或组织切片,加入少量DAPI 染色液,覆盖住样品即可。对于悬浮细胞,至少加入待染色样品体积3 倍的染色液,混匀。
室温放置3-5 分钟,吸除DAPI 染色液,用TBST、PBS 或生理盐水洗涤2-3 次,每次3-5 分钟。
直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时,会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。
其他染料
除了DAPI 染色液外,常见的细胞核染料还包括以下几种:
蓝色:Hoechst 33342(活细胞)、Nuclear Violet LCS1(活细胞)、Nuclear Blue DCS1(死细胞)、DAPI(活&死细胞);
绿色:SYTOX™ Green(活细胞)、DMAO(活细胞)、Nuclear Green LCS1(活细胞)、Nuclear Green DCS1(死细胞);
橙色及红色:Nuclear Orange LCS1(活细胞)、Nuclear Orange DCS1(死细胞)、Nuclear Red LCS1 / LCS2(活细胞)、SYTO™ 深红色(活细胞);
吖啶橙(死细胞)、PI(死细胞)、7-AAD(死细胞)、Ethidium Homodimer-1(死细胞)、Nuclear Red DCS1(死细胞)等。

注意事项
DAPI对人体有一定刺激性,请注意适当防护。
荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测。
为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。
低浓度的DAPI不容易穿透细胞膜。