背景[1-3]
猪水疱病毒(SVDV)PCR检测试剂盒(荧光-探针法)适用于检测Swine Vesicular Disease Virus猪水疱病病毒(SVDV)的RNA，用于Swine Vesicular Disease Virus猪水疱病病毒(SVDV)感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。本产品不提供活体样品做阳性对照，仅提供人工合成的特异性RNA片段标准品作为阳性对照，仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗用途。
猪水疱病病毒（Swine vesicular disease virus,SVDV)属小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属（Enterovirus)的成员。与同属的人类柯萨奇病毒（Humancoxsackievirus)BS型生物学特性十分相似。
病毒粒子呈球形，直径22～32nm，无类脂质囊膜，沉降系数150S。病毒粒子在细胞质内呈晶格排列，在病变细胞质的空泡内凹陷处呈环形串珠状排列，衣壳二十面体对称，病毒基因组为正向单股RNA，有四种结构蛋白，即1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3)和1D（VPl），1A为紧靠病毒核酸的内壳蛋白，1B、1C、1D为外壳蛋白。该病毒无囊膜，只有一种血清型。
本病毒对乙醚和酸稳定，在污染的猪舍内可存活8周以上，在病猪粪便内12～17℃可贮存130d，猪腌肉3个月后仍可分离出病毒，在低温下可保存2年以上。本病毒不耐热，60℃30min和80℃1min即可灭活。
猪水疱病毒(SVDV)PCR检测试剂盒(荧光-探针法)
技术原理:
采用TaqMan一步法荧光定量PCR技术，结合特异性扩增引物对目的基因进行体外扩增，本试剂盒具有灵敏性高、特异性强、反应时间短等优点，操作简便，污染概率低等特点。
产品特点:
特异性好：采用TaqMan荧光探针法进行扩增。
灵敏度高：检测灵敏度可达500copies/uL以下。
操作简便：采用一步法荧光定量PCR进行扩增，逆转录步骤与PCR扩增在一管反应液中完成。
适用仪器：
ABI、安捷伦、Roche、博日，天隆，宏石，鲲鹏等荧光定量PCR仪。
自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。
操作步骤：
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
1.2DNA提取
2.试剂配制（试剂准备区）
3.加样（样本处理区）
4.PCR扩增（核酸扩增区）
5.结果分析判定
6.质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.产品性能指标
阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。
最低检测限：检测灵敏度可达500copies/uL以下。
精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%。
应用[4][5]
猪水疱病毒(SVDV)PCR检测试剂盒(荧光-探针法)可以用于猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究
研究通过一系列分子生物学技术制备了猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗,研究其免疫效果,为猪水疱病和猪瘟新型疫苗的研究探索一条可供参考之路。
1.构建了猪水疱病结构蛋白P1区重组逆转录病毒载体(pBABE puro-P1),并与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293包装细胞,获得了包装完整的假病毒,测定滴度。假病毒经polybrene(8μg/mL)的介导使该假病毒感染靶细胞PK-15,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。间接免疫荧光显示PK-15细胞表达的P1衣壳前体蛋白能被猪水疱病病毒(SVDV)阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;猪水疱病毒(SVDV)PCR检测试剂盒(荧光-探针法)可从不同代次(分别选取第1,8,16代和30代)的阳性细胞中扩增到SVDV的P1基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。2.大量收获阳性细胞培养物,用弗氏佐剂乳化并免疫豚鼠。通过淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA和细胞中和试验,对制备的疫苗效力进行了评价。结果显示,与对照组相比,免疫组豚鼠的外周血淋巴细胞有明显的增殖;阻断ELISA结果表明,免疫组4号豚鼠从首免后的第3周开始出现特异性SVDV抗体,而其他的免疫组豚鼠也从免疫后的第4周开始的全面出现SVDV抗体;应用微量细胞中和试验对免疫接种后第4周、第6周及第8周采集的豚鼠血清中和抗体的滴度进行了检测。结果表明,免疫接种4周时,免疫接种组2号豚鼠的中和抗体为1∶8,其余均小于1∶8;免疫接种组从第6周开始,中和抗体滴度均达到1∶8,甚至超过1∶8,而空白对照组血清中和抗体始终全部小于1∶4。3.采用与猪水疱病类似的方法建立了表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的细胞株。免疫荧光,猪水疱病毒(SVDV)PCR检测试剂盒(荧光-探针法)和ELISA显示,PK-15细胞表达的E2蛋白能被CSFV阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可扩增到不同代次(本次试验分别选取第1,10,20代和30代)阳性细胞基因中的E2基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。
参考文献
[1]Viruses produced from complementary DNA of virulent and avirulent strains of swine vesicular disease viruses retain the in vivo and in vitro characteristics of the parental strain[J].T.Kanno;;T.Inoue;;D.Mackay;;P.Kitching;;S.Yamaguchi;;J.Shirai.Archives of Virology,1998(6)
[2]Molecular cloning and sequence determination of the complete genome of the virulent echovirus 9 strain Barty[J].Holger Zimmermann;;Hans J.Eggers;;Birgit Nelsen-Salz.Virus Genes,1996(2)
[3]The skin,tongue,and brain as favorable organs for hog cholera diagnosis by immunofluorescence[J].I.C.Pan;;T.S.Huang;;C.H.Pan;;Shenq-Yi Chern;;Shu-Hwae Lee;;Y.L.Lin;;B.Y.Huang;;C.C.Lin;;N.J.Li;;J.P.Lin;;Y.H.Yang;;S.Y.Chiu;;J.S.Chang;;D.K.Hue;;H.C.Lee;;C.N.Chang.Archives of Virology,1993(3)
[4]Dengue envelope-based‘four-in-one’virus-like particles produced using Pichia pastoris induce enhancement-lacking,domain III-directed tetravalent neutralising antibodies in mice[J].Ravi Kant Rajpoot;;Rahul Shukla;;Upasana Arora;;Sathyamangalam Swaminathan;;Navin Khanna.Scientific Reports.2018
[5]田宏.猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究[D].西北农林科技大学,2006.