背景[1-3]
猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)适用于检测猪血清、脑、心肌以及淋巴结等组织标本或病毒培养液中指标的mRNA，适用于指标感染的辅助诊断。
猪流行性腹/泻(PED)是由猪流行性腹/泻病毒(PEDV)引起的以腹/泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死亡率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病一年四季均可发生,病猪和隐性感染猪是本病的主要传染源;病毒通过粪-口途径或感染母猪的乳汁进行传播。本病与具有类似临床症/状的猪传/染/性/胃/肠/炎难以区分,荧光PCR技术为这2种病原的鉴别带来便利。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)适用于检测的肠内容物和肠系膜淋巴结、排泄物等标本中猪流行性腹/泻病毒RNA,适用于猪流行性腹/泻病毒感染的辅助诊断。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
适用仪器:
ABI7500、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
标本采集:
剖检猪取肠内容物和肠系膜淋巴结;待检活猪,取排泄物,于离心管中。
保存和运输:
采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过3次。
操作步骤:
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
1.2 RNA提取
2.试剂配制（试剂准备区）
3.加样（样本处理区）
4.PCR扩增（核酸扩增区）
5.结果分析判定
6.质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.产品性能指标
阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。
最低检测限：检测灵敏度可达600copies/uL以下。
精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于5%。
应用[4][5]
猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)可以用于PEDV RT-qPCR检测方法的建立和应用及CHCQ-2023毒株的分离鉴定
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引发猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）的病原体,引起仔猪剧烈腹泻、呕吐、脱水,病死率高达100%,给养猪业造成极大经济损失。目前PEDV仍在猪群中广泛流行,由于病毒基因组的变异率极高,给PEDV的预防和监测带来一定挑战。
基于PEDV N基因及猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法),本研究建立一种RT-qPCR检测方法,并用于检测临床样品,了解川渝地区近两年PEDV流行情况。取阳性病料组织进行病毒分离,获得一株PEDV毒株并命名为CHCQ-2023。并通过体内外试验了解该毒株的增殖和致病情况,通过生物信息学分析了解CHCQ-2023株遗传突变情况,为预防和诊断PEDV提供参考。
主要研究内容及结果如下:1.PEDV RT-qPCR检测方法的建立为建立一种能准确检测PEDV的RT-qPCR方法,首先将NCBI中所有PEDV N基因序列进行比对筛选获得保守片段,针对保守片段设计配对获得9对引物,通过特异性试验筛选出特异性最佳的一对引物组合F4/R5。经反应程序优化后构建标准曲线,方程:y=-3.3221x+44.687,相关系数R2=0.9993>0.99,扩增效率为99.9%,表明本研究建立的RT-qPCR检测方法特异性好、扩增效率高、具有较好的线性关系。为进一步检测本研究建立的RT-qPCR方法的可行性,通过敏感性试验和重复性试验发现,该方法最低检测浓度为2.4×10～1copies/μL,组内变异系数不超过0.2%、组间变异系数不超过2%。为了检验该方法的实际应用效果,采用猪流行性腹泻病毒(PEDV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)与本研究建立的RT-qPCR方法同时检测147份临床腹泻样品。结果显示,本研究建立的RT-qPCR方法检出27份阳性样本,常规RT-PCR检出22份阳性样本,总符合率为96.59%（142/147）。说明本研究建立的RT-qPCR方法具有良好敏感性、重复性和准确性。
参考文献
[1]Investigation of Transmission and Evolution of PEDV Variants and Co-Infections in Northeast China from 2011 to 2022.[J].Feipeng Zhao;Xin'ao Ma;Jianfeng Yang;Zhiying Wei;Jiaxuan Li;Yanping Jiang;Wen Cui;Zhifu Shan;Lijie Tang.Animals:an open access journal from MDPI.2024
[2]Research progress of porcine epidemic diarrhea virus S protein[J].Haojian Luo;Zhaoping Liang;Junjie Lin;Yiqiao Wang;Yingying Liu;Kun Mei;Mengmeng Zhao;Shujian Huang.Frontiers in Microbiology.2024
[3]The Glycosylation Sites in RBD of Spike Protein Attenuate the Immunogenicity of PEDV AH2012/12.[J].Gege Zhang;Qi Peng;Shiyu Liu;Baochao Fan;Chuanhong Wang;Xu Song;Qiuxia Cao;Chengcheng Li;Hong Xu;Hongting Lu;Meiying Bao;Shanshan Yang;Yunchuan Li;Jiaxiang Wang;Bin Li.Virus research.2024
[4]Angiotensin converting enzyme 2 does not facilitate porcine epidemic diarrhea virus entry into porcine intestinal epithelial cells and inhibits it-induced inflammatory injury by promoting STAT1 phosphorylation[J].Li Zhiqiang;Chen Xueqing;Ma Chang;Du Xinyu;Zhang Yuanshu.Virus Research.2024
[5]胡霞.PEDV RT-qPCR检测方法的建立和应用及CHCQ-2023毒株的分离鉴定[D].西南大学,2024.