甲酚紫的结构与性质
甲酚紫又名甲酚青莲，属恶嗪类染料，甲酚紫具有较强的组织穿透能力与良好的生物相容性，常用作动物实验中神经细胞的染色剂。随着激光技术的提出与应用，甲酚紫、吖啶红、罗丹明B、罗丹明6G、香豆素等有机激光染料也随之发展起来;在这个过程中，甲酚紫的光学性质得到了进一步的研究。甲酚紫水溶液呈紫色，其最大吸收和发射波长分别为585 nm和625 nm，可避免生物体系中短波长背景荧光的干扰。此外，甲酚紫具有较高的荧光量子产率（量子产率=0.51）和良好的化学与光稳定性，且光学性质不受常见生物物质的干扰。我们还考察了甲酚紫本身荧光强度随溶液pH的变化情况。由图2可见，甲酚紫在弱酸性溶液，如pH=4.5~5.5中具有强荧光;虽然在生理pH范围（pH=7~8）内荧光略有降低，但仍较强，且此荧光几乎不受生理pH变化的影响。重要的是与试卤灵荧光体的羟基取代反应类似，甲酚紫9-位氨基的取代反应通常也会导致荧光猝灭或波长漂移，而取代基发生反应脱去后，甲酚紫荧光母体被释放出来，荧光也随之恢复。利用这一特性，人们通过在9-位氨基上设置不同的识别单元，设计合成了一系列新的甲酚紫类打开型和比率型光学探针，并用于不同生物分子的检测与荧光成像分析。此外，人们利用带正电荷的甲酚紫及其衍生物与纳米材料间的静电吸附作用，发展了不同的纳米光学探针，也获得了良好的应用。
图1 甲酚紫(10 μmol/L)的荧光随溶液pH的变化情况
（λex/λem=585/625 nm;20 mmol/L的不同pH磷酸盐缓冲液）
在蛋白酶检测中的应用
甲酚紫类探针在蛋白酶活性检测方面取得了显著进展。研究者通过在9-位氨基上引入不同酶的识别基团，开发出一系列高选择性的荧光探针。例如：硝基还原酶探针：基于硝基的荧光猝灭效应，探针本身几乎无荧光，与硝基还原酶反应后释放甲酚紫，荧光显著增强，可用于缺氧细胞和斑马鱼体内酶的成像。
谷胱甘肽转移酶探针：通过磺酰胺基与甲酚紫连接，探针在酶作用后断裂磺胺键，荧光恢复，适用于细胞提取物和活细胞中酶的检测。
γ-谷氨酰转肽酶探针：该探针对酶具有高度选择性，荧光增强达500倍，已用于临床血清样品和癌细胞中酶的可视化检测。
亮氨酸氨肽酶探针：具有超高灵敏度（检出限0.42 ng/mL），可用于评估癌细胞对顺铂的抗药性。
此外，针对成纤维活化蛋白、二肽基肽酶4、丙氨酸氨肽酶等酶的探针也相继被开发，部分探针已实现多种酶的同步成像，为肿瘤研究和药物筛选提供了新工具。
在小分子检测中的应用
甲酚紫类探针也可用于检测小分子物质。例如：
三聚氰胺检测：基于其对甲酚紫共振荧光的抑制作用，建立了高灵敏度的检测方法，适用于奶粉样品分析。
硫化氢检测：通过叠氮基的还原反应，设计出比率型荧光探针，可用于活细胞和斑马鱼中H2S的成像分析，揭示其本底浓度低于0.1 μmol/L。
辅酶Q10检测：利用磁性脂质体与甲酚紫组装，结合流动系统实现食品中辅酶Q10的高灵敏检测。
在pH检测中的应用
甲酚紫对pH的敏感性也使其成为pH探针的设计基础。其在中性条件下可穿过生物膜，在酸性细胞器（如溶酶体）中发生质子化并积聚，适用于细胞内pH的动态监测。近年来，研究者还将甲酚紫与荧光黄共包覆于纳米脂质体中，构建比率型pH探针，成功用于炎症细胞模型中pH变化的检测。
图2 甲酚紫对pH的响应
参考文献
[1] 张昊琳, 胡一鸣, 马会民. 甲酚紫类光学探针的研究进展[J]. 分析科学学报, 2017, 33(05): 700-706.