Ic-ELISA检测猪肉中2-三氟甲基吩噻嗪的含量

前言

2-三氟甲基吩噻嗪(2-(trifluoromethyl) phenothiazine,TFPTZ),又名三氟拉嗪主环,是一种人工合成的吩噻嗪类镇静剂,在常温下为淡黄色粉末,分子式为C13H8F3NS,相对分子质量为267.27,2-三氟甲基吩噻嗪通常用于治疗精神疾病,也可作为三氟拉嗪、氟奋乃静的中间体。对动物具有镇静催眠、消除狂躁不安的作用。

在饲料或饮用水中违法添加2-三氟甲基吩噻嗪可以使禽畜快速增重、缩短出栏时间。在动物运输过程中使用2-三氟甲基吩噻嗪还可以减少体重下降和防止肉品质降低,但残留在动物源食品中的2-三氟甲基吩噻嗪及其代谢产物会对人的神经系统造成不良影响,严重危害消费者的身体健康。根据文献要求,氯丙嗪、地西泮等仅允许治疗使用,动物源食品中不得检出，国际食品法典委员会、欧盟、澳大利亚等国家和组织均对镇静剂的最高限量值作出了规定。目前禽畜养殖行业中仍有一些不法分子使用2-三氟甲基吩噻嗪获取利益,为确保动物源食品安全,亟需开发一种快速定量分析动物源食品中2-三氟甲基吩噻嗪残留量的检测方法。

检测方法^[1]

1、Ic-ELISA方法的建立

抗原包被:用包被液(0.01mol/L碳酸盐缓冲溶液)将完全抗原稀释后包被到酶标板上，每孔150uL,37℃孵育1h,包被液倾出，每孔加入200uL PBST洗液,静止1min,倾去洗液,拍干,重复洗板3次。封闭:每孔加入150uL，封闭液,37℃孵育1h,洗板3次。竞争反应:每孔加入75ul用PBS稀释16000倍的多克隆抗体和75ul稀释后的2-三氟甲基吩噻嗪标准品，37℃竞争反应1h,倾去酶标板中的液体,洗板3次。每孔加入150uL稀释2000倍的酶标二抗,37℃孵育1h,洗板3次。显色:每孔加入150ul TMB单组分显色剂，37℃反应20min。加入终止液(体积分数10%硫酸)50uL,上机测定OD₄₅₀。

2、Ic-ELISA标准曲线的建立

按上述优化条件,将2-三氟甲基吩噻嗪标准品梯度稀释(10.00,5.00,2.50.1.00,0.50,0.25,0.10ug/L),每个质量浓度重复3次。以OD₄₅₀为纵坐标,以2-三氟甲基吩噻嗪质量浓度的对数为横坐标绘制标准曲线,用Origin软件进行线性拟合,计算2-三氟甲基吩噻嗪的IC₅₀线性范围(IC₂₀~IC₈₀)和最低检测限(IC₁₀)。

3、实际样品检测及高效液相色谱(HPLC)验证

鲜猪肉去脂肪后做成肉糜,分别取20g,加入4ml,不同质量浓度(5.0,12.5,25.0,50.0 ng/mL)的2-三氟甲基吩噻嗪标准品，加入20mL乙腈和0.5mL质量分数40%氢氧化钠溶液，振荡2min,超声10min,4 000r/min离心5min,吸取2mL上清液,氮气吹干,用PBS稀释至1mL,按步骤1将样品的检出值乘以稀释倍数,即为Ic-ELISA 法测得的猪肉样品中2-三氟甲基吩噻嗪含量。HPLC验证在安捷伦1260系统上进行,选用安捷伦ZORBAX SB-C₁₈分析色谱柱,流动相A为乙腈,流动相B为体积分数0.2%的甲酸水溶液,洗脱液体积比为9:1,25℃下流速为0.2mL/min,进样量为20ul，检测器为二极管阵列检测器。

参考文献

[1] 刘广兴,韩晓利,李昳晴,等. 猪肉中2-(三氟甲基)吩噻嗪的Ic-ELISA检测[J]. 河北大学学报（自然科学版）,2023,43(6):638-645. DOI:10.3969/j.issn.1000-1565.2023.06.010.