4-硝基苯基 β-D-葡糖苷酸英文名：4-Nitrophenyl β-D-glucuronide，CAS号：10344-94-2，白色至淡黄色结晶粉末，易溶于水、缓冲液，主要用于葡萄糖醛酸苷酶底物，酶促反应生成 4‑硝基苯酚，在碱性条件下显黄色，可用于比色法测定酶活，广泛用于：临床生化检测，微生物鉴定（如大肠杆菌检测），分子生物学与药理学实验。
应用
专利CN202110794195.1实施例1：以PNZ为氨基保护基的三糖中间体3mer‑2的制备，取500mg4-硝基苯基 β-D-葡糖苷酸(GlcA‑PNP)、1.2倍当量的UDP‑GlcNTFA及适量KfiA酶置于50mmol/L、pH＝7.3且含6mmol/L MnCl2的Tris‑HCl缓冲液，反应液总体积为300mL，室温过夜反应。以PAMN‑HPLC(检测波长为310nm)检测反应进程，至底物转化率为93％，反应液用三氟乙酸调调pH＝2‑3，用C18柱层析(3cm×50cm)纯化得二糖骨架2mer‑4。 以得到的二糖为底物，连同1.2倍当量的UDP‑GlcA、适量PmHS2酶混合于上述缓冲液中，终体 积为200mL，室温过夜反应，PAMN‑HPLC测得底物转化率达98％，反应液调pH＝2‑3，于C18柱层析纯化得三糖骨架3mer‑1，PAMN‑HPLC测得其纯度>96％，ESI‑MS测定其分子量为748.36Da[1]。
从新鲜马蓝叶提取β-葡萄糖苷酶,通过单因素试验优化提取工艺,最佳提取条件为液料比10∶1(mL∶g)、提取溶剂为4℃的pH值为6.0的50mmol/L磷酸缓冲液、匀浆时间60s、浸提时间1h,过滤后得到粗酶液;之后通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到β-葡萄糖苷酶,纯化后该酶比活力为121.89U/mg,与粗酶液相比,纯度提高了22.31倍,酶回收率为20.15％。对该酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该酶的最适反应温度为50℃,在40～50℃条件下具有较好的热稳定性;在4℃无菌条件下保存20d,相对酶活力仍保持在80％以上;最适pH值为6.0,在pH值为4.0～7.0体系内稳定性较好;测得以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的酶的米氏常数(Km)为3.40mmol/L,最大反应速度(Vmax)为9.27μmol/(L·min);Ca2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、乙醇、异丙醇、抗坏血酸、尿素、乙二胺四乙酸(EDTA)和草酸对酶活无明显影响;Cu2+、Fe2+、Ag+、甲醇、乙酸乙酯和十二烷基磺酸钠(SDS)均会不同程度地抑制酶的活性,K+和丙酮对酶活有一定促进作用[2]。
参考文献
[1] 山东大学. 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用:CN202110794195.1[P]. 2021-11-19.
[2] 杨潇然,周昊,薛兴颖,等. 马蓝叶β-葡萄糖苷酶的提取分离及酶学性质研究[J]. 林产化学与工业,2025,45(3):79-86. DOI:10.20195/j.issn.0253-2417.2024046.