PFU DNA POLYMERASE 是一种来源于超嗜热古菌Pyrococcus furiosus的DNA聚合酶，属于B家族DNA聚合酶。与广泛使用的Taq DNA聚合酶相比，PFU DNA POLYMERASE 最显著的特征在于其具有3'→5'外切核酸酶活性，能够在DNA合成过程中识别并切除错误掺入的碱基，从而显著降低PCR扩增的突变率。有研究表明，PFU DNA POLYMERASE 在PCR反应中的突变率仅为2.6%，是所有热稳定聚合酶中最精确的聚合酶之一。在分子生物学研究中，PFU DNA POLYMERASE 广泛应用于对保真度要求极高的实验场景，包括基因克隆、定点突变、DNA测序和全基因合成等。
PFU DNA POLYMERASE 表达宿主的选择
PFU DNA POLYMERASE 基因来源于嗜热古菌，其DNA序列中A/T含量较高，在大肠杆菌中表达时可能面临稀有密码子不足的问题。采用实验室保藏的含PFU DNA POLYMERASE 基因重组质粒的菌株，通过响应面法优化获得了高产量的PFU DNA POLYMERASE [1]。而另一研究则系统比较了BL21(DE3)与Rosetta(DE3)两种宿主对PFU DNA POLYMERASE 表达量的影响。结果显示，Rosetta(DE3)菌株由于能够补充稀有密码子对应的tRNA，其PFU DNA POLYMERASE 的表达量显著高于BL21(DE3)系统，从400 mL培养液中可获得约30 mg纯化后的PFU DNA POLYMERASE [2]。相比之下，在BL21(DE3)中相同培养规模的PFU DNA POLYMERASE 产量仅为6 mg左右。因此，对于PFU DNA POLYMERASE 的高效表达，Rosetta(DE3)是更为理想的宿主菌株[2]。
优势与局限
PFU DNA POLYMERASE 最核心的优势是其高保真性，非常适用于对序列准确性要求极高的实验。其次是耐热性高，比Taq酶更稳定，在95°C孵育1小时后仍能保持90%以上的活性，允许将变性温度提高至98°C以处理GC含量高的模板。但是PFU DNA POLYMERASE 也有其局限性，首先就是延伸速度慢，Pfu的扩增效率较低，其典型延伸速度仅为每分钟500至1000个碱基。相比之下，Phusion高保真DNA聚合酶的处理能力比Pfu高10倍。另外因其3'→5'外切酶校正活性，Pfu酶在室温下可能从3'端降解引物，使用时需特别注意。还有就是Pfu扩增的PCR产物为平末端，无3'端“A”突出，不能直接使用常规的TA克隆，需使用平末端克隆载体或对产物进行加A处理。
参考文献
[1] 欧阳乐军, 李莉梅, 布梁灏, 等. Pfu DNA聚合酶的表达条件优化及纯化研究[J]. 基因组学与应用生物学, 2019, 38(12): 5458-5464.
[2] 何华华, 胡晓韵, 王婷, 等. Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化[J]. 湖北大学学报(自然科学版), 2019, 41(3): 223-227.