背景[1-6]
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,10-well是浓度10-20%聚丙烯酰胺凝胶，可将各种蛋白质重复分离成具有两倍负载能力的良好分辨的条带。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于传统的Laemmli蛋白电泳，可以使用Laemmli样品和运行缓冲液。
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,10-well不含SDS，可用于以天然或变性形式运行蛋白质。对于变性蛋白质，建议使用Novex Tris-Glycine SDS样品缓冲液和Novex Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液。对于天然蛋白质，建议使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels具有创新的楔形孔，其样品负载量比其他1.0 mm厚的凝胶多两倍。楔形井也有较大的开口，使样品装载更容易。为了将蛋白质转移到膜上，建议在使用Invitrogen Mini Blot模块进行传统湿转移时使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干转移进行转移使用iBlot 2凝胶转移装置进行Invitrogen Power Blotter或快速干转移。Novex Value Tris-Glycine Mini Gels可满足的蛋白质分离需求提供价格和性能的完美平衡。Novex Value Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶以基于传统Laemmli蛋白电泳的经济型凝胶提供良好的蛋白质分离和分离度。每个盒子包含20个凝胶。
Novex Value凝胶的特点包括：
•卓越的价值和性能平衡-非常适合定性分析（例如，筛选，蛋白质纯化验证）
•快速运行条件-在不到60分钟的时间内使用恒定电压分离蛋白质
•天然和天然的选项变性蛋白质分析
应用[7][8]
用于新型抗氧化蛋白PAMM及其在破骨细胞分化和雌激素缺乏所致骨质疏松中的作用研究。
破骨细胞的形成和分化是机体维持骨稳态的重要环节,也是骨质疏松等病理过程发生的关键因素。研究证明,活性氧(reactive oxygen species,RO S)在破骨细胞分化和骨代谢中具有重要作用。因此,进一步研究阐明破骨细胞中的氧化还原调节及抗氧化防御系统及其在骨质疏松中的作用对骨质疏松等骨骼疾病防治,发展骨代谢疾病治疗的新策略新方法并研究开发以ROS为靶点的抗氧化治疗药物具有重要意义,已成为目前国内外研究的热点和重要的研究方向。
我们在破骨细胞中发现了一个过氧化物酶-2(Peroxiredoxin-2,PRX-2)家族的新成员并将其命名为“巨噬细胞集落刺激因子刺激的单核细胞中活化的过氧化物酶类分子(PRX-like 2 Activated in M-CSF stimulated Monocytes,PAMM)",其序列与PRXs相类似且都含有许多氧化还原酶的共同结构特征——CXXC结构,表明PAMM可能是一种具有氧化还原活性的蛋白分子。因ROS在破骨细胞分化和骨代谢中的重要意义,我们推测PAMM可能在破骨细胞分化及骨质疏松中发挥重要作用。
因此,本研究主要从四个方面展开对PAMM的系统研究阐明：
(1)PAMM分子的主要特性及其表达；
(2)PAMM在RANKL诱导的破骨细胞分化中的作用；
(3)PAMM的抗氧化活性；
(4)PAMM在雌激素缺失所致骨质疏松的作用及PAMM在雌激素的骨保护效应中的作用,旨在揭示PAMM是一个能调节破骨细胞分化的氧化还原调节蛋白,为骨质疏松等骨骼疾病防治,发展骨代谢疾病治疗的新策略和新方法和研发以ROS为靶点的抗氧化治疗药物提供干预作用的新的靶分子。
方法：
(1)PAMM分子的发现及其主要特性的研究：使用微阵列杂交(Microarray hybridization)技术对RANKL刺激的RAW264.7细胞以及M-CSF+RANKL刺激的正常小鼠骨髓单核细胞(BMM)进行全基因组表达进行筛选,发现并命名了PAMM,根据结构特点初步确定其抗氧化功能；获取小鼠主要组织器官蛋白提取物,Western Blot分析PAMM在各组织器官中的表达；转染HEK293细胞’Western Blot检测上清液中PAMM的表达；检测在破骨细胞分化过程中PAMM mRNA(Real Time PCR)和蛋白(免疫荧光和免疫组织化学染色)的表达,以及PAMM在Csf-1突变tl/tl大鼠补充M-CSF前后骨髓细胞中的表达。
(2)PAMM对破骨细胞分化的影响：以RAW264.7细胞为基础,建立PAMM稳定转染细胞系PAMM#1和PAMM#2,TRAP染色检测PAMM高表达对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响,并检测在补充H2O2后对破骨细胞分化的影响；Western Blot检测PAMM稳定转染细胞分化过程中NF-κB和c-Jun活性的变化；构建PAMM突变质粒C85G和C88G并转染细胞检测其对破骨细胞分化的影响,确定此过程中PAMM分子中CXXC组件的重要作用。
参考文献
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[2]Alpha‐Lipoic Acid Promotes Osteoblastic Formation in H2O2‐Treated MC3T3‐E1 Cells and Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats[J] . Chao Fu,Dong Xu,Chang‐Yuan Wang,Yue Jin,Qi Liu,Qiang Meng,Ke‐Xin Liu,Hui‐Jun Sun,Mo‐Zhen Liu. J. Cell. Physiol. . 2015 (9)
[3]Indole-3-carbinol as inhibitors of glucocorticoid-induced apoptosis in osteoblastic cells through blocking ROS-mediated Nrf2 pathway[J] . Hao Lin,Xiang Gao,Guanghua Chen,Jiecong Sun,Jiaqi Chu,Kaipeng Jing,Peng Li,Rong Zeng,Bo Wei. Biochemical and Biophysical Research Communicatio . 2015 (2)
[4]Sex Steroid Actions in Male Bone[J] . Dirk Vanderschueren,Micha?l R. Laurent,Frank Claessens,Evelien Gielen,Marie K. Lagerquist,Liesbeth Vandenput,Anna E. B?rjesson,Claes Ohlsson. Endocrine Reviews . 2014 (6)
[5]Schisantherin A suppresses osteoclast formation and wear particle-induced osteolysis via modulating RANKL signaling pathways[J] . Yi He,Qing Zhang,Yi Shen,Xia Chen,Feng Zhou,Dan Peng. Biochemical and Biophysical Research Communications . 2014 (3)
[6]Nrf2 deficiency induces oxidative stress and promotes RANKL-induced osteoclast differentiation[J] . Seungha Hyeon,Hyojung Lee,Yoohee Yang,Woojin Jeong. Free Radical Biology and Medicine . 2013
[7]The Keap1/Nrf2 Protein Axis Plays a Role in Osteoclast Differentiation by Regulating Intracellular Reactive Oxygen Species Signaling[J] . Hiroyuki Kanzaki,Fumiaki Shinohara,Mikihito Kajiya,Tetsuya Kodama. Journal of Biological Chemistry . 2013 (32)
[8]许琰. 新型抗氧化蛋白PAMM及其在破骨细胞分化和雌激素缺乏所致骨质疏松中的作用[D].昆明医科大学,2016.