一甲基澳瑞他汀 F（MMAF），全称单甲基澳瑞他汀 F（Monomethyl Auristatin F,MMAF），是一种强效微管蛋白抑制剂与细胞毒性药物，主要用作抗体偶联药物（ADC）的毒性载荷。
制备方法[1]
S1：(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
向(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(100mg,0.347mmol)和L-苯丙氨酸(107.8mg,0.500mmol)的DMF(5mL)溶液中加入氰基膦酸二乙酯(75.6uL,0.451mmol),随后加入Et3N(131uL,0.94mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时,然后升温至室温,并搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释,用1N硫酸氢钾水溶液(40mL),水(40mL),饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤,用硫酸钠干燥,真空浓缩。通过柱层析(15-75%乙酸乙酯/正己烷)纯化残余物,得到标题化合物(130mg,83%产率),为白色固体。
S2：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((叔丁氧基羰基)-(甲基)氨基)3-甲氧基-5-甲基庚基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸
向(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)(0.29mmol))和(3R,4S,5S)-4-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-3-甲氧基-5-(4-甲氧基苯基氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(96.6mg,0.318mmol)在DMF(5mL)里的混合溶液中加入氰基膦酸二乙酯(58uL,0.347mmol),然后加入Et3N(109uL,0.78mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时,然后升温至室温，搅拌过夜。用乙酸乙酯(80mL)稀释反应混合物,用1N硫酸氢钾水溶液(40mL),水(40mL),饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤,用硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱层析(15-75%乙酸乙酯/正己烷)纯化残余物,得到标题化合物(150mg,81%产率),为白色固体。
S3：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚)-吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯
向((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((叔丁氧基羰基)-(甲基)氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(0.118mmol) 和Boc-Val-OH(51.8mg,0.236mmol)的DCM(5mL)溶液中加入溴-三(二甲基氨基)-六氟磷酸辚(BroP,70.1mg,0.184mmol),然后加入二异丙基乙胺(70uL,0.425mmol)。将混合物避光,并在0C搅拌30分钟,然后在室温搅拌2天。用乙酸乙酯(80mL)稀释反应混合物,用1N硫酸氢钾水溶(40mL),水(40mL),饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤,硫酸钠干燥并真空浓缩。通过柱层析(20-100%乙酸乙酯/正己烷)纯化残余物，得到标题化合物(67mg,77%产率),为白色固体。
S4：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12-((S)-仲丁基)二异丙基-13-甲氧基2,2,5,11四甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮癸-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯
向(S)-1-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(0.091mmol) 和Boc-N-Me-Val-0H(127mg,0.548mmol)的DMF(5mL)溶液中加入氰基膦酸二乙酯(18.2uL,0.114mmol)，然后加入4-甲基吗啉(59uL,0.548mmol)。.将反应混合物在0℃搅拌2小时,然后升温至室温,搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释,用1N硫酸氢钾水溶液(40mL),水(40mL),饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤,用硫酸钠干燥,真空浓缩。通过柱层析(20-100%乙酸乙酯/正已烷)纯化残余物,得到标题化合物(30mg,39%产率),为白色固体。
S5：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12-((S)-仲丁基)9二异丙基-13-甲氧基-2,2,5,11-四甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮癸-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸
向(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12-((S) -仲丁基)二异丙基-13-甲氧基-2,2,5,11-四甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮癸15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-(1-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(30mg,0.035mmol)的四氢呋喃(1.0ml)溶液中加入LiOH水溶液(1.0M,0.8ml)。将混合物在室温下搅拌35分钟,用0.5M H3P04中和至pH6,浓缩并在SiO2柱上纯化,用CH3OH/二氯甲烷/HOAc (1:10:0.01)洗脱,得到标题化合物(25.0mg,85%收率)。
S6：一甲基澳瑞他汀 F
将(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((6S,9S,12S,13R)-12-((S)-仲丁基)-69-二异丙基-13甲氧基-2,2,5,11-四甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮-癸-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-2-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸(25mg,0.030mmol),浓HCl(0.3ml)和1,4-二氧六环(0.9ml)的混合物在室温下搅拌35分钟，然后用EtOH(1.0ml)和甲苯(1.0mI)稀释,浓缩后再用乙醇/甲苯(2:1)稀释、浓缩,得到一甲基澳瑞他汀 F,为白色固体(22mg,~100%收率)用于下一步,无需进一步纯化。LC-MS(ESI)m/z C39H65N5O8[M+H]+计算值732.48,实测值:732.60。
参考文献
[1] 苏州美康加生物科技有限公司. 新型连接体及其用于药物和生物分子的特异性偶联:CN201580082582.5[P]. 2018-07-17.