背景及概述
叶酸杂质C别名异叶酸（Isofolic Acid），CAS：47707-78-8，是欧洲药典EP法定关键杂质，分子式，分子量441.4，为叶酸蝶啶环位置异构体，是叶酸原料药质控重点项目。叶酸母核为6-亚甲基取代蝶啶，杂质C蝶啶环在7位连亚甲基氨基苯甲酰谷氨酸，骨架组成一致、空间异构，理化性质与叶酸高度近似，分离难度大。
理化特性
叶酸杂质C为淡黄色类结晶粉末，水溶性偏弱，溶于稀碱溶液、碳酸氢钠水溶液，难溶于醇、丙酮；紫外最大吸收280nm，酸碱稳定性同叶酸，酸性加热易水解断裂酰胺键，强光照射加速蝶啶环氧化降解；pKa约3.52，极性略大于叶酸，HPLC出峰紧邻主峰，是叶酸检测最难分离杂质之一。无叶酸生理活性，无法参与体内一碳代谢，药典严格限定原料药限度≤0.5%（EP标准）。
质控与应用
药典统一采用C18反相HPLC检测叶酸杂质C，缓冲盐-甲醇梯度洗脱，波长280nm，控制单杂限度[1]；杂质C对照品专供药企原料、片剂、注射液质量检验、方法学验证、药典标定。原料超标需优化蝶啶中间体精馏、缩合温度控温（35~40℃）减少异构生成。叶酸杂质C无药用价值，仅作为杂质标准物质，是叶酸API国内外申报必检项目。
图1 叶酸杂质C质控图谱
制备与对照品合成
实验室制备叶酸杂质C分两条路线：①化学合成：以2-氨基-4-氧代-7-氯甲基蝶啶与对氨基苯甲酰-L-谷氨酸缩合，弱碱性室温缩合，酸化析出粗品，制备型HPLC纯化，得到≥98%对照品；②原料药富集提纯：叶酸粗品碱溶，制备色谱分离富集杂质C馏分，浓缩酸化结晶精制，多用于药典标定对照品，产业化无量产价值，仅杂质标品小批量合成。
参考文献
[1]魏炜.色质联用分析叶酸杂质谱和未知残留溶剂.[J]浙江工业大学.2016-10-01.