维生素B12测定用培养基是一种专门设计的、不含维生素B12的营养基质，用于通过微生物法精确检测样品中维生素B12的含量。在婴幼儿食品和乳制品中，维生素B12的含量是衡量其营养价值的重要指标之一。由于维生素B12在食品中含量极微，且需要检测其生物活性，微生物法被公认为仲裁方法[2]。
检测原理
微生物法测定维生素B12的原理，是利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的高度特异性。在维生素B12测定用培养基中，除维生素B12外，菌株生长所需的所有氨基酸、碳源、盐类及其他维生素均已完备供给。因此，菌株的生长量（通过浊度或吸光度反映）完全依赖于外界添加的维生素B12量[2]。
维生素B12测定用培养基本底对线性的直接影响
通过系统的对比实验，揭示了不同品牌的维生素B12测定用培养基对标准曲线线性的显著影响。使用本底较高的维生素B12测定用培养基时，即使将培养基稀释一倍使用，接种空白管依然有明显生长。这导致低浓度点的响应被“抬高”，而高浓度点的相对生长优势减弱，标准曲线的线性不佳，R²值仅为0.96左右，且常需要剔除高浓度点才能勉强成线[1]。
相比之下，使用几乎不含本底的维生素B12测定用培养基时，接种空白管几乎无生长，标准曲线呈现出良好的梯度正生长，R²值可达0.995以上。实验进一步证实，当维生素B12测定用培养基不含本底时，菌悬液浓度和培养时间的微小变化只会影响整体吸光度值的大小，而不会破坏曲线的线性关系[1]。通过结果得出结论，维生素B12测定用培养基的本底是标准曲线失败或线性不良的首要原因。只有选择低本底甚至零本底的培养基，才能获得理想的线性结果。
操作中的关键控制点
即便选用了优质的维生素B12测定用培养基，微生物法本身操作环节多，仍需严格控制。试管和移液管必须用20%盐酸浸泡，再以蒸馏水冲洗干净，并在200℃下干热灭菌2-3小时。任何洗涤剂或油渍残留都会异常促进菌株生长，破坏实验梯度[2]。接种前，菌悬液的透光率应控制在60%-80%（通常以75%为宜）。菌液过浓会导致所有试管生长过盛，梯度不明显；菌液过稀则生长不足，延长培养时间[2]。每次测定样品时，必须同步使用相同批次的维生素B12测定用培养基制备标准曲线，并包含质控样，以确保结果的准确性。
法规标准与菌株
在我国，使用维生素B12测定用培养基方法依据GB 5009.285-2022《食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定》。标准方法中通用的测试菌株为莱士曼氏乳杆菌 Lactobacillus leichmannii，推荐使用菌株编号ATCC 7830。
参考文献
[1] 陈绪华， 刘健， 江一飞. 不同测定培养基对维生素B12线性的影响[J]. 生物技术世界， 2013(4): 47,131.
[2] 鲁盛静， 田野. 婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定的探讨[J]. 中国乳品工业， 2013, 41(2): 50-52, 55.