叶酸是一类对人体健康至关重要的B族维生素，其缺乏是一个全球性的健康问题，会导致如巨幼细胞贫血，心血管疾病恶化和某些类型癌症等疾病；胎儿缺乏会发生神经管缺陷等相关疾病。叶酸由对氨基苯甲酸连接蝶呤组成，其中对氨基苯甲酸能够与一个或多个谷氨酸偶联，形成单谷氨酸叶酸或多谷氨酸叶酸。天然叶酸以四氢叶酸及其衍生物的形式存在，如5-甲基四氢叶酸（5-methyl-tetrahydrofolate，5-MTHF）、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸等。5-甲基四氢叶酸是食品中最主要的天然叶酸形态，在一些主要蔬菜中，5-甲基四氢叶酸含量超过叶酸总量的85%，而在某些水果中则接近100%；5-甲基四氢叶酸生物活性高，是唯一可直接作用于甲基化循环的叶酸形态，缺乏5-甲基四氢叶酸易诱发高同型半胱氨酸血症；我国已将5-甲基四氢叶酸作为食品营养强化剂列入食品添加剂的范围，对其添加量、摄入量和适宜人群等做了相应规定。
近年来，越来越多的研究人员通过营养强化育种提高谷物中叶酸含量，摄取叶酸强化食物已成为全球对抗叶酸缺乏症的策略之一。鲜食玉米营养丰富香糯可口，消费人群旺盛，在我国种植面积逐年增加。本文所用原材料京科糯928玉米是高叶酸强化玉米，叶酸含量为普通玉米5～10 倍，且5-甲基四氢叶酸含量占比高，可作为叶酸补充食品。
制备方法[1]
1、样品制备
玉米样品为京科糯928品种，在收获采摘后，脱粒混匀以减少玉米穗个例间差异；随后使用液氮速冻，储存于-80℃环境中。待使用样品时，取出置于球磨仪中1000r/min研磨90s，制备玉米样品匀浆。
2、溶液配制
叶酸浸提液：使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制100mmol/L pH6.5磷酸钠缓冲溶液，在磷酸盐缓冲液中加入0.01g/mL抗坏血酸和体积分数0.5% β-巯基乙醇溶液以配制为叶酸浸提液。
标准品储备液、工作液：分别精确称取5-MTHF标准品5.0mg于50.0mL棕色容量瓶中，用叶酸浸提液溶解并定容至刻度，即得100μg/mL标准储备液。将标准储备液稀释至不同质量浓度以配制成标准工作液。
酶溶液：分别精准称取10mg蛋白酶及100mg α-淀粉酶溶于5mL超纯水中，配制2mg/mL的蛋白酶溶液和20mg/mL的α-淀粉酶溶液。
SPE洗脱液：取5g氯化钠、0.5g抗坏血酸钠以及0.05mL β-巯基乙醇于50mL容量瓶中，用0.1mol/L乙酸钠溶液定容，配制为SPE洗脱液。
3、玉米籽粒中叶酸提取条件
在De Brouwer等的提取叶酸和5-甲基四氢叶酸的方法基础上进行优化。取1g玉米匀浆与5mL叶酸浸提液涡旋混合为叶酸提取液。样品充分混匀后，沸水浴处理5min。在冰上冷却至室温后加入一定量的α-淀粉酶（12U/mL），37 ℃水浴振荡器中温浴30min。取出后添加一定量的蛋白酶（0.028U/mL），37 ℃水浴，1h后进行沸水浴5min。冰上冷却后加入一定量的大鼠血清（14μL/mL），37℃水浴4h。水解完成后煮沸5min，冷却至室温。4℃、14000×g离心15min，上清液过0.22μm滤膜，为待净化提取液。
4、叶酸的形态转化
由于玉米中天然叶酸形态多样，主要形态为5-甲基四氢叶酸，为简化玉米中总叶酸含量的分析，将各种形态的叶酸全转化为5-甲基四氢叶酸以测定玉米样品中总叶酸含量，转化步骤参考Ndaw等的方法。
取5mL待净化叶酸提取液，加入66mmol/LpH7.8 Tris缓冲液15mL，再加入1mL 2-辛醇以消泡；随后加入10mL 120g/L NaBH4溶液，混匀后静置10min；用5mol/L乙酸调节pH值至7.4。加入80μL 37%甲醛溶液；振荡混匀后，1min内小心加入10mL 120g/L NaBH4溶液。然后用37%浓盐酸调pH值小于1.0，溶液静置10min后用5mol/L NaOH溶液调pH5，再次小心加入10mL 120g/L NaBH4溶液，溶液振荡均匀后静置20min；用Tris缓冲液将溶液的体积定容到100mL；溶液分层后将上层的2-辛醇去除。剩余溶液过0.45μm滤膜，为叶酸形态转化后的待净化总叶酸提取液。
5、提取液的SPE净化
首先分别使用2×2.5mL甲醇和2×2.5mL超纯水以1～2滴/s的流速活化固相萃取小柱。测定5-甲基四氢叶酸含量或总叶酸含量时，吸取2.5mL待净化提取液，加到活化后的SPE小柱上，流出速率同样为1～2滴/s，样品吸附完毕后，使用2.5mL超纯水清洗小柱。随后使用3.2mL SPE洗脱液缓慢（流速不超过1滴/s）洗脱叶酸。收集目标物洗脱液，过0.22μm滤膜，将净化样品液转移到HPLC进样瓶中，为HPLC待测液。
参考文献
[1] 王博伦,顾丰颖,张帆,等. 玉米中5-甲基四氢叶酸提取方法的优化及高效液相色谱法定量分析[J]. 食品科学,2020,41(18):196-202.