BRS3 （铃蟾肽样受体3，也叫蛙皮素受体亚型-3）是铃蟾肽受体家族（bombesin receptor family，BnR）成员，属于 Gq 偶联的七次跨膜 G 蛋白偶联受体。它的特殊之处在于至今没有找到内源性配体，因而被归为孤儿受体，功能研究只能借助人工合成的肽类激动剂与拮抗剂来驱动。通过BRS3抗体，能识别和研究蛙皮素受体亚型-3（BRS-3）蛋白，成为实验和科研的一大助力。
用 Pep #1 刺激稳定表达 BRS3 的 HEK 293-BRS3 细胞，取 1、2、4、8、12 小时五个时间点，每点三次技术重复、两次生物学重复，经 Nano LC-MS/MS 共鉴定并定量 1593 种蛋白，其中差异表达蛋白 465 种（倍数变化≥1.50 或≤0.66，P<0.05）。通路富集把响应指向 mTOR，21 种蛋白参与其中，再用 pS6K（#9234）、S6K（#2708）、p4EBP1（#2855）、4EBP1（#9644）与 GAPDH 的免疫印迹证实 BRS3 激活上调 mTORC1，拮抗剂 Bantag-1 预孵育 30 分钟可将其阻断[1]。实验中，HEK 293 细胞中 BRS3 表达量极低，且是由钙流阴性反推而得，若用BRS3抗体检测受体，就会得到BRS3蛋白的具体数量和表达位置，为科研提供更详细的实验数据。
将12 只雄性山羊分 3 月龄与 9 月龄两组，免疫组化用 BRS3抗体 1:150，固定与包埋后切片，并以一抗来源动物血清替代一抗作阴性对照。免疫印迹把同一 BRS3抗体稀释到 1:1000，配兔抗 ACTB（1:3000）作内参、HRP 标记驴抗兔 IgG（1:4000）作二抗，ECL 显影后用 Image J 读灰度。定位结果是：3 月龄山羊睾丸的间质细胞与肌样细胞呈微弱表达，9 月龄则在间质细胞、肌样细胞和精子中呈强表达。mRNA 与蛋白两个层面均显示 BRS3 随发育显著升高。同一抗体通过 1:150 与 1:1000 两种稀释比、跨组化与印迹两种场景，其结果都得出了可参考的着色与条带[2]。
把 BRS3抗体用到妇科肿瘤，宫颈癌与良性组织配对比较，免疫组化用 BRS-3 抗体 1:200、4 ℃ 过夜，抗原经柠檬酸缓冲液高压或微波修复，5% BSA 封闭后接二抗 37 ℃ 30 分钟，DAB 显色，按染色强度（0 至 3）乘以阳性范围（0 至 4）评分。结果显示 BRS-3 蛋白多表达于细胞膜，宫颈癌组评分高于良性组，基因与蛋白层面同时升高。细胞侧再用 LV-BRS3 过表达慢病毒与 siRNA-BRS3 双向干预 Hela 细胞，免疫印迹读出 BRS-3、GSK3β、RPS6KB1、PI3K、AKT 与 p-AKT（10% SDS-PAGE、PVDF 膜、5% 脱脂牛奶封闭 1 小时、一抗 4 ℃ 过夜、二抗 37 ℃ 1 小时），结论是 BRS3 通过增强有氧糖酵解促进增殖[3]。
综合来看，BRS3 是七次跨膜的膜蛋白，样品处理要控温、减少反复冻融。而它与 NMBR、GRPR 同属一个家族，序列同源性在 44% 至 62% 之间，要避免交叉识别。挑选 BRS3抗体时需要注意，表位是否避开家族保守区并以 NMBR、GRPR 过表达裂解液作阴性对照。物种覆盖是否及得上山羊、人源组织与 Hela 细胞这三种样本。能否在变性印迹与固定后组化两种场景复用。以及是否有拮抗剂阻断或受体沉默组可供反证。
参考文献
[1] 董莉杰. HEK 293细胞中BRS3受体激活的蛋白质组学研究[D]. 上海: 上海交通大学, 2020.
[2] 曾诚, 夏荣欣, 李悦, 等. 神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的差异表达[J]. 南京农业大学学报, 2023, 46(3): 538-544.
[3] 王新梅, 陈怡樵, 何雨, 等. 蛙皮素受体亚型-3在宫颈癌细胞能量代谢中的作用及机制探讨[J]. 解放军医学院学报, 2024, 45(11): 1151-1158.