背景[1-5]
大鼠视网膜血管内皮细胞分离自视网膜组织；视网膜居于眼球壁的内层，是一层透明的薄膜。视网膜由色素上皮层和视网膜感觉层组成，两层间在病理情况下可分开，称为视网膜脱离。 色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞组成，它们具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。组织学上视网膜分为10层，由外向内分别为：色素上皮层、视锥、视杆细胞层、外界膜、外颗粒层、外丛状层、内颗粒层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层、内界膜。
视网膜内层为衬于血管膜内面的一层薄膜，有感光作用；后部鼻侧有一视神经乳头。视网膜上的感觉层是由三个神经元组成。神经元是视细胞层，专司感光，它包括锥细胞和杆细胞。视杆细胞主要在离中心凹较远的视网膜上，而视锥细胞则在中心凹处最多。第二层叫双节细胞，约有10到数百个视细胞通过双节细胞与一个神经节细胞相联系，负责联络作用。第三层叫节细胞层，专管传导。视网膜是一层菲薄的但又非常复杂的结构，它贴于眼球的后壁部，传递来自视网膜感受器冲动的神经纤维跨越视网膜表面，经由视神经到达出口。视网膜的分辨力是不均匀的，在黄斑区，其分辨能力最强。它是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。
应用[6]
应用IL-10修饰的内皮祖细胞对非增生期糖尿病视网膜病变发展的影响和分子机制的研究。
建立过表达IL-10的EPCs,明确IL-10对EPCs生物学特征的影响;研究IL-10修饰的EPCs对非增生期糖尿病视网膜病变病情的影响,并探讨其作用途径。方法:(1)采用密度梯度离心法提取出生后7天~9天的雄性Wistar大鼠骨髓中的单个核细胞,将其接种培养于预先使用纤维连接蛋白包被的培养板中;培养7天后,利用Dil标记的乙酰低密度脂蛋白(Dil-ac LDL)和FITC标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-I)双标免疫荧光细胞化学染色法,以及FITC标记的血管性血友病因子(FITC-v WF)、PE标记的血管内皮生长因子受体2(PE-VEGFR2)免疫荧光细胞化学染色法鉴定EPCs。并将慢病毒包装的IL-10质粒(EPC-LV-IL-10-GFP)或空白质粒感染EPCs(EPC-LV-NC-GFP),感染48~72小时后荧光显微镜下观察感染效率,并采用流式细胞仪、Transwell法、成管能力和粘附能力实验检测观察各组细胞的细胞周期、迁移、成管和粘附功能。
采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测量各组细胞培养基中多种炎性因子的表达量。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定各组细胞中信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路中相关因子表达的变化。
结果:(1)正常细胞组中,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间细胞粘附、迁移和成管能力无显著性差异(F=1.414,1.817,0.025,P=0.25,0.169,0.976),各组细胞分布于G1期、S期、和G2期的比例基本相同;培养基中加入重组大鼠TNF-α诱导后,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间细胞粘附、迁移和成管能力有显著性差异(F=8.260,135.903,13.246,P=0.001,0,0.011)。EPC-LV-IL-10-GFP组细胞粘附、迁移及成管能力较其他两组显著增加,差异均有统计学意义(P=0.001,0.001;0,0;0.013,0.009)。
(2)ELISA检测:正常细胞组中,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间培养基中TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF浓度比较,差异均有统计学意义(F=28.910,14.242,10.795,26.097,P=0,0,0.002,0);EPC-LV-IL-10-GFP组与EPC组、和EPC-LV-NC-GFP组相比,TNF-α和IL-8的浓度明显下降(P=0,0;0.002,0.001);IL-10和VEGF的浓度明显升高(P=0.012,0.025;0,0),差异均有统计学意义。
培养基中加入重组大鼠TNF-α诱导后TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF浓度检测结果与以上结果相似,差异均有统计学意义(F=52.734,5.16,10.067,28.157,P=0,0.024,0.003,0);EPC-LV-IL-10-GFP组与EPC组、和EPC-LV-NC-GFP组相比,TNF-α和IL-8的浓度明显下降(P=0,0;0.002,0.002);IL-10和VEGF的浓度明显升高(P=0.012,0.025;0,0),差异均有统计学意义。
参考文献
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