RMP（又称URI）是RNA聚合酶II第五亚基RPB5的调节蛋白，其促癌作用已在卵巢癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中得到证实[1]。RMP抗体是深入探索和特异性识别RMP蛋白的工具。
RMP多克隆抗体的制备及其在肝癌细胞凋亡研究中的应用
首先通过RT-PCR检测了HT-29、A549、Hep-2、SGC-7901、293T、HeLa、WI-38和SMMC-7721共8种细胞系中RMP的表达，发现RMP在所有细胞系中均有表达但程度不同，其中Hep-2和293T相对较高，HT-29最低[2]。研究者从质粒中PCR扩增人RMP基因，克隆至原核表达载体，经IPTG诱导表达GST-RMP/D1融合蛋白，通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。Western blot鉴定显示，该RMP抗体在抗原量低至20μg时仍能特异性检测到RMP蛋白，效价和特异性均满足后续实验要求。利用该抗体，研究者在稳定过表达RMP的SMMC-7721肝癌细胞中证实了RMP蛋白的表达，并通过⁶⁰Co γ射线照射诱导DNA损伤与凋亡模型，发现过表达RMP的肝癌细胞凋亡率显著低于对照细胞，表明RMP能够减少肝癌细胞凋亡[2]。
RMP抗体在胆管癌抗氧化与奥沙利铂耐药机制研究中的应用
万正华在论文中将RMP抗体应用于胆管癌抗氧化能力和药物耐受机制的系统研究，研究通过慢病毒建立差异表达RMP的胆管癌细胞系（HuCCT1和TFK-1），利用RMP抗体进行Western blot验证过表达和干扰效率，并进一步在裸鼠皮下荷瘤和肺转移模型中通过免疫组化检测RMP、NRF2、Ki67和8-OHdG的表达。研究发现，在常规2D培养条件下，差异表达RMP的胆管癌细胞在增殖、迁移和平板克隆能力上无显著差异，但在软琼脂3D培养和裸鼠体内模型中，过表达RMP显著促进肿瘤生长和肺转移，而干扰RMP则对其有抑制作用[1]。机制层面发现：RMP通过其D2区域（而非D1或D3区域）竞争性结合KEAP1蛋白的Kelch结构域，从而减少NRF2的泛素-蛋白酶体降解，增强NRF2蛋白稳定性。RMP抗体在免疫荧光实验中也证实了RMP与KEAP1在胆管癌细胞中的共定位。进一步的CHX追踪实验利用RMP抗体检测NRF2蛋白半衰期，发现过表达RMP延长NRF2半衰期，而干扰RMP加速其降解[1]。在临床样本中，RMP抗体用于免疫组化分析81例肝内胆管癌组织，发现RMP高表达患者总生存期和无病生存期均显著缩短，且RMP与NRF2表达正相关。该研究还通过RMP抗体在PDX原代细胞中验证了RMP对奥沙利铂耐药性的影响[1]。
RMP抗体在食管鳞癌增殖与放化疗抵抗研究中的应用
陈少慕在论文中将RMP抗体应用于食管鳞状细胞癌增殖机制及预后评估研究[3]。首先通过qRT-PCR和Western blot检测RMP在食管鳞癌细胞系Eca109和Ec9706中的表达，RMP抗体证实了RMP在食管鳞癌细胞中较正常食管上皮细胞HEEC显著高表达。在临床样本层面，对30例食管鳞癌组织及配对癌旁组织进行RMP蛋白检测，发现癌组织中RMP表达明显升高，且RMP表达与淋巴结转移状态和T分期显著相关[3]。在功能实验中，RMP抗体用于Western blot检测放疗后凋亡相关蛋白的表达变化，过表达RMP的Eca109和Ec9706细胞在放疗后Bcl-2表达升高、Bax表达降低，而干扰RMP则相反，表明RMP通过调节凋亡相关基因的蛋白表达来减少放疗引起的细胞凋亡[3]。此外，RMP抗体还用于裸鼠皮下移植瘤模型的免疫组化分析，证实过表达RMP促进移植瘤生长，同时伴随Bcl-2升高和Bax、caspase-3降低。在第二部分临床研究中，研究者采用免疫组化法对59例食管鳞癌石蜡标本进行RMP表达检测，单因素分析显示RMP表达与总生存期显著相关，RMP阳性患者生存期短，提示RMP可能是预后差的指标[3]。
参考文献
[1] 万正华. RMP调控胆管癌抗氧化能力和药物耐受的作用和机制研究[D]. 上海: 海军军医大学, 2019.
[2] 仲蕾, 王晓婷, 郭云兰, 等. RMP基因的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响[J]. 苏州大学学报(医学版), 2011, 31(5): 689-693.
[3] 陈少慕. RMP在食管鳞状细胞癌增殖中的作用机制研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2018.