免疫沉淀(IP)裂解液和试剂

免疫沉淀是一种能够纯化蛋白质的方法。将目标蛋白质的抗体与细胞提取物一起孵育，抗体会与溶液中的蛋白质结合。通过使用蛋白A/G偶联的琼脂糖珠将抗体/抗原复合物从样品中提取出来 。这可以将目标蛋白质与样品的其余部分分离。然后通过SDS-PAGE分离样品进行蛋白质印迹分析。

裂解缓冲液

理想的裂解缓冲液将最大限度地减少蛋白质变性，同时从样品中释放足够量的蛋白质。NP-40和Triton X-100等非离子型去污剂的刺激性低于SDS和脱氧胆酸钠等离子型去污剂。其他可能影响免疫沉淀成功的变量包括了盐浓度、二价阳离子浓度和pH值等。为了优化变量，应在以下范围内测试它们：

-盐：0-1 M

-非离子洗涤剂：0.1-2%

-离子洗涤剂：0.01-0.5%

-二价阳离子：0-10 mM

-EDTA：0-5 mM

-酸碱度：6-9

非变性裂解缓冲液

用于可溶于去污剂且可被抗体以天然形式识别的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。

-20 mM Tris HCl pH 8

-137 mM 氯化钠

-1% Nonidet P-40 (NP-40)

-2 mM EDTA

4°C下最多可保存6个月，使用前立即添加蛋白酶抑制剂。

为方便起见可配制10%脱氧胆酸钠储备液(5g加入50mL)，必须避光。

不含去垢剂的可溶性蛋白裂解缓冲液

一些可溶性蛋白质可能不需要使用洗涤剂。此缓冲液用于机械细胞裂解，例如使用杜恩斯匀浆器进行匀浆。

PBS含有：

-5mM EDTA

-0.02%叠氮化钠

4°C下最多可保存6个月，使用前立即添加蛋白酶抑制剂。

非去污剂可溶性抗原的变性裂解缓冲液

仅识别变性蛋白质的抗体无法接近天然蛋白质的表位。收获和裂解细胞时，在变性裂解缓冲液中加热细胞。该方法也可用于无法用非离子去污剂从细胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑制剂将有助于从染色质中提取蛋白质。

1% SDS

5mM EDTA

室温下最多可保存1周。

使用前立即添加

10 mM二硫苏糖醇或β-巯基乙醇

蛋白酶抑制剂15 U/mL

洗涤缓冲液

-10mM Tris;调节pH至7.4

-1mM EDTA

-1mM EGTA；pH8.0

-150mM氯化钠

-1% Triton X-100

-0.2mM原钒酸钠

-蛋白酶抑制剂混合物

4°C下最多可保存6个月。使用前立即添加蛋白酶抑制剂。

其他试剂

蛋白酶抑制剂

细胞裂解后，蛋白水解、去磷酸化和变性过程就开始了。将样品放在冰上会减慢这些过程，但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。如果不使用混合物，PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用于免疫沉淀的蛋白酶抑制剂。

其他试剂

-无菌PBS pH 7.4

-无菌PBS-BSA 1% w/v(过滤)

-TBST缓冲液

-用于蛋白质印迹的上样/样品缓冲液

-VeriBlot用于免疫沉淀二抗，在蛋白质印迹过程中优先检测未还原、未变性 的一抗。

-100mM EDTA库存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中制成。添加NaOH 将pH调节至7.4。最后将总体积调整至50 mL。

制备裂解物

细胞培养物裂解物(非变性)

1，将细胞培养皿置于冰上，并用冰冷的PBS清洗细胞。

2，排干PBS，然后添加冰冷的裂解缓冲液(1mL每107个细胞/100mm2培养皿 /150cm2烧瓶；0.5 mL每5×106个细胞/60mm2培养皿或75cm2烧瓶)。

3，使用冷塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后将细胞悬浮液轻轻转 移至预冷的微量离心管中。

4，在4°C下保持恒定搅拌30分钟。

5，在4°C的微量离心机中离心。

您可能需要根据细胞类型改变离心力和时间。原则是12,000 rpm，20分钟， 但您应该针对您的特定实验进行优化(例如，白细胞需要非常轻微的离心)。

6，轻轻地从离心机中取出管子并置于冰上。吸出上清液并置于冰上的新管中， 并丢弃沉淀。 

细胞培养物裂解物(变性)

1，将100μL变性裂解缓冲液添加到0.5-2×107个细胞中。

2，以最大速度剧烈涡旋2-3秒充分混合。将细胞悬液转移至微量离心管中。由 于DNA的释放，溶液在此阶段可能会变得粘稠。

3，将样品加热至95°C，5分钟使其变性。

4，用0.9 mL非变性裂解缓冲液稀释悬浮液，轻轻混合。

非变性裂解缓冲液中过量1% Triton X-100会淬灭原始变性缓冲液中的SDS。

5，将裂解的悬浮液通过连接到1 mL注射器的针头5-10次，从而打碎DNA。

通过重复机械破坏，直到粘度降低。如果 DNA存在未完全消化和片段化， 可能会干扰离心后沉淀与上清液的分离。

6，在冰上孵育5分钟。

7，继续进行免疫沉淀。

组织裂解物

1，用干净的工具尽快解剖组织。如果可能，请在冰上进行以防止蛋白酶降解。

2，将组织放入圆底微量离心管中，浸入液氮中快速冷冻。将样品储存在-80°C 下供以后使用或保存在冰上以便立即均质化。

3，对于约5 mg的组织片，将约300 μL裂解缓冲液快速添加到管中，并用电动 匀浆器匀浆。

4，每次冲洗时用另外300 μL裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4°C下保持恒 定搅拌2小时(例如置于冰箱中的定轨摇床上)。

裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织量来确定。蛋白质提取物不应太稀，以避免蛋白质损失并尽量减少上样到凝胶上的样品体积。最低浓度0.1mg/mL；最佳浓度为1–5mg/mL。

如果需要变性样品，使用变性裂解缓冲液并执行上述变性方案中的步骤2-5。

5，在微量离心机中于4°C下以12,000 rpm离心20分钟。轻轻地将管从离心机 中取出并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中丢弃沉淀。

预清除裂解物

预清除裂解物有助于减少非特异性结合并降低背景。但如果蛋白质的最终检测是通过蛋白质印迹法进行，则不需要预清除，除非污染蛋白质干扰了目标蛋白质的可视化。

1，将50 μL与免疫沉淀抗体相同种类和同种型的脱靶抗体或正常血清(通常首 选兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小时。

2，将100 μL珠浆添加到裂解液中。

3，在 4°C下孵育10–30分钟，并轻轻搅拌。

4，在微量离心机中于4°C以14,000 g旋转10分钟。

5，丢弃珠粒并保留上清液用于免疫沉淀。

为了提高产量，可以在裂解缓冲液中将珠子洗涤1或2次以上，并将上清液 收集在一起。

重要的是要确保尽可能多地去除正常血清。为了确保这一点，可以使用裂解缓冲液代替样品进行测试，并执行上述所有预清除步骤。

将所得上清液进行凝胶电泳并用考马斯染色显示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除，重链和轻链将出现50和25kDa的条带；它的存在可能会导致免疫沉淀反应较弱。考虑减少血清量或增加预澄清步骤中与样品一起孵育的珠子量。​

参考文献

1.Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1 -8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

2.Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

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