郁金香碎色病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

郁金香碎色病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

郁 金 香 碎 色 病 毒
探 针 法 荧 光 定 量  RT- PCR 试 剂 盒
Tu lip  b reaki ng  Pot y vi rus   P ro be  RT - q P C R  K it产品及特点

本试剂盒可用于检测郁金香碎色病毒。郁金香碎色病毒（Tulip breaking Potyvirus ， TBV）属马铃薯 Y 病毒科马铃薯 Y 病毒属，只侵染郁金香属(Tulipa spp.)和百合属(Lilium spp.)植物，导致郁金香和百合的花瓣和叶片出现斑驳的杂色条纹，感染 TBV 的郁金香不 仅表现出花色杂色，而且植株也会退化。本产品是根据探针法荧光定量 RT-PCR 原理开发 的郁金香碎色病毒检测试剂盒，它具有下列特点：
1.   即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.   引物等组分经过优化，灵敏度高。
3.   提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.   特异性高，引物是根据郁金香碎色病毒 RNA 序列高度保守区设计，不会跟其他 病毒的 RNA 发生交叉反应。
5.   既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个 数量级。
6.   本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7.   本产品只能用于科研。
 
成分规格
 

 
 保存条件

低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试 剂。
 郁金香碎色病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
使用方法
一、RNA 提取(样本制备区)
用自选方法提取纯化样品 RNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。建 议使用病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒（Cat:GZ010702-50）提取 RNA。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样 品或本试剂盒的其他成分）。
1.    标记 6 个离心管，分别为 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2.    用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3.    在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL  的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟， 得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.    换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.    换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.    重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
若有 N 个待检样品，准备 N+2 个 qPCR 管(N 个待检样品+1个阴性对照+6 个阳性对 照) ，向各 qPCR 管中分别加入下列成分。

郁金香碎色病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
转移至样本准备区。
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 5 μl 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、 郁金香碎色病毒 RT-qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
 

六、结果分析
1.  如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制 标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，推算出 其浓度。
2.  如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照（1×10E5 拷贝/μL）结果：Ct 值<30 ，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲 线。
阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<38 ，有明显指数增长，表明样本中检测出该病毒，结果为阳  性；Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出该病毒，结果为阴性；Ct 值在38-40 范  围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，有明显指数增长，则判 定为阳性，否则为阴性。
 
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