凝胶材质
琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸电泳中最常用的两种凝胶基质。两种材料都能形成三维基质，用于核酸的分离。
凝胶材质的选择，主要取决于核酸样品的大小和期望达到的分辨率。琼脂糖凝胶可用于分离0.05-50kb的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于3kb的核酸分子。 某些情况下，可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率。
琼脂糖凝胶和聚丙烯凝胶之间的差异
|
琼脂糖 |
聚丙烯酰胺 |
DNA分离范围
50-50,000 bp
5-3,000 bp
A)琼脂糖凝胶
琼脂糖溶液加热并冷却后，就会形成凝胶基质，用于核酸电泳。由于琼脂糖凝胶加热可逆，因此，通过溶解含有目的片段的凝胶，可提取电泳分离出的核酸。
* 确定琼脂糖比例
通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。琼脂糖凝胶的含量与分离核酸大小成反比。
推荐百分比琼脂糖凝胶用于DNA片段分离
| 凝胶百分比 |
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.2
1.5
2.0
3.0
4.0
5.0
高效分离的范围(bp)
2,000-50,000
1,000-20,000
800-12,000
800-10,000
600-10,000
400-8,000
300-7,000
200-3,000
100-2,000
25-1,000
10-500
10-300
凝胶比例计算为:凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%
* 用于核酸电泳的琼脂糖选型：
生化级琼脂糖适用于普通核酸电泳；
Wide range琼脂糖可用于分离碱基数量较低的DNA，约50-1000bp；
低熔点琼脂糖适用于DNA提取，也是凝胶内酶反应的理想选择；
低EEO琼脂糖，纯度更高，有助于和加快核酸条带电泳速度、减少条带扩散并提高电泳分辨率；
高分辨率琼脂糖可用于分离碱基数量差异在2%左右的小DNA片段（20-800bp）。
琼脂糖
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
琼脂糖
for biochemistry
9012-36-6
5g,25g,100g,500g
琼脂糖
Wide range(multipurpose)
9012-36-6
5g,25g,100g
琼脂糖
High resolution, DNase, RNase, NICKase, none detected
9012-36-6
25g,100g
琼脂糖
low EEO
9012-36-6
5g,25g,100g,500g
低熔点琼脂糖
低熔点,适用于分离小的核酸片段
9012-36-6
5g,25g
B)聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物，通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。 交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发。在既定温度下，APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
* 聚丙烯酰胺组分选型
核酸分离，通常采用 3–30% (%T)的聚丙烯酰胺凝胶。
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%
%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺常用组分及应用
丙烯酰胺:bis |
%C |
相对孔隙大小 |
研究应用 |
29:1
3.3%
中
非变性凝胶中ssDNA和RNA
* 确定聚丙烯酰胺比例
在凝胶中，丙烯酰胺和双丙烯酰胺(简称为“bis”)的总浓度(以%T表示)决定了孔隙大小。%T百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子越小。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
| 丙烯酰胺（%） |
3.5
5.0
8.0
12.0
15.0
20.0
有效分范围(bp)
100~2000
80~500
60~400
40~200
25~150
10~100
* 确定配方（以50ml体系为例：）
| 成分 |
丙烯酰胺：Bis
10*TBE
TEMED
10% APS
dd H2O
浓度
目标浓度
总体积的1/10
0.5μl/ml
5μl/ml
补足体积
丙烯酰胺：双丙烯酰胺的组分-可预先制备成原液，方便使用。
丙烯酰胺：双丙烯酰胺为神经毒素，实验时应使用防护设施，小心操作。
聚丙烯酰胺凝胶组分
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
丙烯酰胺
电泳专用级
79-06-1
25g,100g,500g
N，N′-亚甲基双丙烯酰胺
电泳级, ≥99.0% (T)
110-26-9
25g,100g,500g
四甲基乙二胺(TEMED)
用于电泳,99%
110-18-9
25ml,100ml
过硫酸铵APS
99.99% metals basis
7727-54-0
25g,100g,500g
电泳缓冲液
电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应尽量相同，确保有效的导电性。
电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程，其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液。
缓冲液选择指南
缓冲液 |
产品优势 |
缺点 |
核酸分辨率包装 |
TAE
▪可更好地分离大片段
▪缓冲能力低；更适用于短时间运行
▪适合于下游的酶学应用
▪更容易导致过热
＞1,000bp
＞1500
TBE
▪适用于短片段（线性dsDNA在TBE中迁移慢10%）
▪离子强度高、缓冲能力强；适用于长时间运行
▪不易导致过热
▪抑制酶，不适合下游酶学步骤（如克隆）
＜5,000bp
＜1500碱基
检测dsDNA和RNA，一般在变性琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的条件下进行。在缓冲液中加入变性剂会破坏核酸之间的氢键，减少二级结构的生成。常见的变性剂有：琼脂糖凝胶，磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH- EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等；聚丙烯酰胺凝胶，TBE缓冲液中的尿素。
生物缓冲液
常见变性剂
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
甲酰胺
分子生物学级,≥99.5%
75-12-7
100ml,500ml,2.5L
乙二醛溶液
用于分子生物学,40% in H2O(8.8 M)
107-22-2
25ml,100ml
二甲基亚砜
分子生物学专用,≥99.9%
67-68-5
250ml
尿素
电泳级,≥99.5% (T)
57-13-6
500g,1Kg
染料
核酸样品染色的两种常用方法，包括:1)凝胶内染色；2)电泳后染色。
凝胶内与电泳后染色的利弊
方法 |
优势 |
注意事项 |
凝胶内染色
▪更便利
▪工作流程更快
▪所需染色更少
▪在长时间运行后，染色可能会消失
▪染色剂只能使用一次
▪可能改变样品迁移性
电泳后染色
▪提供更精确的分子大小分析
▪允许重复使用染色液或多个凝胶同时染色
▪工资流程耗时长
▪所需染色剂较多
▪可能会产生较多有害物质
A）凝胶内染色
使用荧光核酸染色剂，是核酸内染色的常用方法。可在琼脂糖凝胶制备时加入推荐浓度核酸染色剂(常用溴化乙锭0.5 μg/mL)。
荧光核酸染色剂
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
溴化乙锭(EB)
分子生物学级,粉末,≥95% (HPLC)
1239-45-8
1g,5g,25g
B）电泳后染色
电泳后染色常用银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。
常规步骤如下：
（1）取下凝胶放入染色盒中用蒸馏水冲洗2次；
（2）固定：将胶放于固定液中振荡，固定10min；
（3）氧化：倒出固定液，水洗后用1%硝酸氧化3min，用蒸馏水漂洗2次，每次2s；
（4）染色：放入银染液中避光染色30min；
（5）洗涤：蒸馏水漂洗15s；
（6）显色：放入显色液中显色；
（7〕停显：待有清晰条带出现（背景不太深时）倒出显色液，加入10%乙酸终止显色；
（8）水洗，成像。
固定液、染色液、显色液成分：
固定液：10%乙醇，0.5%乙酸
银染液：0.2%硝酸银，用之前加200ul甲醛（250ml银染液中）
显色液：1.5%氢氧化钠，0.5%甲醛
银染相关试剂
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
乙醇
分子生物学专用,≥99.8%
64-17-5
500ml
硝酸银标准溶液
0.1000mol/L(0.1N)
7761-88-8
1L
甲醛溶液
用于分子生物学, ≥36.0% in H2O (T),含10~15%甲醇稳定剂
50-00-0
100ml,500ml
氢氧化钠
ACS,97%
1310-73-2
500g,12*500g
上样缓冲液
上样缓冲液通常包含密度成分、盐、金属螯合剂、染料。密度成分帮助样品沉入凝胶孔中，金属螯合剂，螯合样品中的核酸酶，防止核酸的讲解，染料指示用于电泳的进展。
琼脂糖凝胶中，溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小
|
溴酚蓝 |
二甲苯青FF |
0.5
750bp
1,150bp
13,000bp
16,700bp
0.6
540bp
850bp
8,820bp
11,600bp
0.7
410bp
660bp
6,400bp
8,500bp
0.8
320bp
530bp
4,830bp
6,500bp
0.9
260bp
440bp
3,770bp
5,140bp
1.0
220bp
370bp
3,030bp
4,160bp
1.2
160bp
275bp
2,070bp
2,890bp
1.5
110bp
190bp
1,300bp
1,840bp
2.0
65bp
120bp
710bp
1,040bp
3.0
30bp
60bp
300bp
460bp
4.0
18bp
40bp
170bp
260bp
5.0
12bp
27bp
105bp
165bp
聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小
Loading Buffer 常见组分举例：
10 mM Tris-HCl (pH 7.6)
60 mM EDTA
0.03% 溴酚蓝
60% 甘油
Loading Buffer 常见组分
产品号 |
名称 |
级别 |
Cas |
规格 |
备注 |
三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)
用于分子生物学和细胞培养,≥99.0%(AT)
1185-53-1
100g,500g
盐
二甲苯青FF
分子生物学级
2650-17-1
5g,25g
指示剂
溴酚蓝
Indicator
115-39-9
10g,25g,50g
指示剂
甘油
无菌,for molecular biology
56-81-5
100ml
密度成分
乙二胺四乙酸二钠,二水
分子生物学和电泳级,99%
6381-92-6
100g,500g
螯合剂