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上海阿拉丁生化科技股份有限公司

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阿拉丁蛋白定量试剂

发布日期:2020/6/1 10:00:37发布人:上海阿拉丁生化科技股份有限公司

 

 

蛋白质浓度测定常用比色法。其中,BCA法和Bradford法定量是最常用的蛋白浓度测定方法。每种蛋白质定量方法都有其局限性,在选择蛋白质定量方法时,最需要考虑的特性是灵敏度、与样品中常见物质的相容性(如洗涤剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲液)、标准曲线线性和蛋白质之间的差异等。

蛋白定量BCA法和Bradford法对比

  BCA法 Bradford法
测定范围
20–2000 µg/mL
100-1500 µg/mL
检测原理
在碱性的条件下,蛋白质将碱性Cu(II)还原为Cu(I)。两分子的二辛可宁酸(BCA)螯合一个Cu(I),形成紫色的反应复合物。该复合物的水溶液在562nm处显示强烈的吸光性
在试剂的酸性环境中,蛋白能与考马斯染料结合。这导致染料的最大吸收发生位移,从红棕色形式转化为蓝色形式。蛋白-染料结合物在595nm波长下吸收最大
优点
兼容大多数去垢剂
蛋白定量方法中,测定最快速,方法最简单,且在室温下进行
蛋白质间差异性小于Bradford法
与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容
缺点
能还原铜离子的物质也能造成显色,影响定量的准确性
与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容
与铜离子螯合的试剂,DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色(半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)
与BCA法相比,蛋白质之间的差异性较大
需要孵育温度以及时间的消耗
-

BCA法

试剂配制

1、BCA试剂

A) 试剂A:分别称取1%(w/v)BCA ,2%(w/v)Na2CO3·H2O,0.16%(w/v)Na2C4H4O6·2H2O,0.4%(w/v)NaOH,0.95%(w/v)NaHCO3,用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

B)试剂B:4%(w/v)CuSO4·5H2O。

C)BCA试剂:试剂A:试剂B=50:1,混合均匀。

2、牛血清蛋白标准(BSA)标准蛋白质母液:配制成5mg/ml的BSA标准溶液(配制溶液需与待测样品溶液保持一致)。

实验操作

1、配制标准曲线待测样品:用标液配置溶液稀释BSA母液10倍,至浓度为0.5mg/ml。取96孔酶标板,按下表加入试剂

序号
1
2
3
4
5
6
7
8
0.5mg/mlBSA溶液(μl)
0
1
2
4
8
12
16
20
标液配置溶液(μl)
20
19
18
16
12
8
4
0
蛋白质浓度(mg/ml)
0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5

每份标样分别加入BCA试剂200μl。

2、配制待测样品:准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中,加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释,稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整,一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。

3、样品处理:轻摇,于37℃保温30-60min,冷却至室温。

4、测定:以空白为对照,在酶标仪上562nm处比色,以牛血清白蛋白含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照,根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。

 

BCA法试剂

产品号 名称 级别 Cas 规格
2,2'-联喹啉-4,4'-二甲酸二钠(BCA)
98%
979-88-4 
1g,5g,25g
碳酸钠,一水
ACS
5968-11-6
1g,50g,250g
酒石酸钠二元二水合物
AR, ≥99%
6106-24-7
100g,500g
氢氧化钠
AR,96%,颗粒状
1310-73-2
500g,12*500g,20*500g
碳酸氢钠
AR,≥99.8%
144-55-8
500g,12*500g,20*500g,10Kg
硫酸铜,五水
AR,99%
7758-99-8
500g,20*500g
牛血清白蛋白含量标准物质
98%
9048-46-8 
200mg

Bradford法

试剂配制

1、染色剂:0.01%考马斯亮蓝G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇。

2、牛血清蛋白标准(BSA)标准蛋白质母液:配制成10mg/ml的BSA标准溶液(配制溶液需与待测样品溶液保持一致)。

实验操作

1、配制标准曲线待测样品:

A)在BSA母液中加入标液配置溶液,配置一组浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的BSA溶液。

序号
1
2
3
4
5
6
10mg/mlBSA母液(μl)
0
20
40
60
80
100
标液配置溶液(μl)
1000
980
960
940
920
900
蛋白质浓度(mg/ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1

B)对于上述配制好的BSA溶液,再用P标液配置溶液分别稀释10倍。

序号
1
2
3
4
5
6
步骤A配置完成的BSA溶液(μl)
100
100
100
100
100
100
标液配置溶液(μl)
900
900
900
900
900
900
蛋白质浓度(mg/ml)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1

C)分别移取50μl步骤B中配制好的一组待测标准BSA溶液,滴加到孔板中,再分别加入200μl考马斯亮蓝G250。静置10min后检测。

2、配制待测样品:准确吸取50μl样品溶液于孔板中,加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释,稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整,一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。

3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照,根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。

 

 

Bradford法试剂

产品号 名称 级别 Cas 规格
考马斯亮蓝G250
AR
6104-58-1
5g,10g,25g,100g,200g
磷酸
AR, ≥85 wt. % in H2O
7664-38-2 
500ml,12*500ml,2.5L
乙醇(95%)
AR,95.0%
64-17-5 
500ml,12*500ml,20*500ml,4*5L,10L,25L
PBS缓冲液
-
500ml
PBS缓冲液
10×
-
100ml,500ml,1L
牛血清白蛋白含量标准物质
98%
9048-46-8 
200mg

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