铁死亡（Ferroptosis）作为一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡方式，以脂质过氧化积累和抗氧化防御系统崩溃为核心特征，在肿瘤治疗、神经退行性疾病和代谢性疾病研究中展现出巨大潜力。其独特死亡机制不同于凋亡、坏死或焦亡。今天小E老师将系统阐述铁死亡细胞模型的制备与检测方案，为疾病机制研究和药物开发提供实验工具。
（1）一、调控机理
铁死亡的核心机制在于谷胱甘肽（GSH）耗竭，其主要调控通路包括：谷胱甘肽/GPX4通路、FSP1-CoQ10通路、GCH1-BH4 通路以及线粒体DHODH-CoQ通路。当谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性下降时，脂质过氧化物无法通过GPX4催化的谷胱甘肽依赖的还原反应被清除，导致脂质过氧化积累。同时，二价铁离子（Fe2+）通过芬顿反应催化脂质过氧化物产生活性氧（ROS），最终触发铁死亡。
同时，二价铁离子（Fe²⁺）的存在催化了脂质过氧化链式反应的启动和传播，导致脂质过氧化物（尤其是磷脂氢过氧化物）在细胞膜上大量积累，最终破坏细胞膜结构并引发铁死亡。
图1. 铁死亡的调控通路
（2）二、铁死亡检测方案
建立能模拟人类疾病中铁死亡过程的细胞模型（原代细胞、细胞系）和动物模型（小鼠、大鼠等）；如CRISPR/Cas9敲除/敲入、shRNA/siRNA敲低、过表达、转基因/条件性敲除小鼠模型等。
GSH/GSSG比值检测、GPX4活性/蛋白水平、SLC7A11/xCT蛋白水平/功能、FSP1蛋白水平/定位/活性、ACSL4蛋白水平等。
铁离子探针、铁蛋白水平、转铁蛋白饱和度、铁染色检测。
ROS聚集流式/荧光显微镜检测、LPO、MDA、4-HNE检测（生化或ELISA或WB法）、质谱脂质组学分析。
排除凋亡、坏死、焦亡等（通过形态学观察、caspase活性检测法、LDH释放差异分析、线粒体功能检测、GSDMD检测（生化/WB/ELISA等方法）进行区分）。
（3）三、实验结果
① 形态观察和细胞内亚铁离子检测
图2. HepG2细胞使用不同浓度（0、50、100 μM）的RSL3诱导48 h后使用Fe2+探针（E-BC-F101，1:100）37℃孵育30 min，荧光显微镜拍照并分析结果。和正常组的细胞相比，铁死亡的细胞内铁离子积聚增加，细胞形态变化不明显，细胞质内颗粒度明显增加。
② 细胞内亚铁离子、GSH、MDA代谢检测
图3. Raw264.7细胞使用GSH assay kit（E-BC-K030-M）)和MDA assay kit（E-BC-K028-M）以及Ferrous Iron assay kit（E-BC-K881-M）(检测并分析结果，减少ZIP8（SLC39A8编码蛋白）可缓解LPS诱导的MDA和亚铁离子含量升高，并逆转GSH水平的下降。（文献参考PMID: 38103342）
图4. DU145细胞和PC3细胞使用GSH assay kit（E-BC-K030-M）和MDA assay kit（E-BC-K028-M）(以及Ferrous Iron assay kit（E-BC-K881-M）检测并分析结果。（文献参考PMID 39856701）
图5. 软骨细胞使用Cell Ferrous Iron(Fe2+)Fluorometric Assay Kit（E-BC-F101）检测检测牛磺酸处理后IL-1β诱导的软骨细胞中Fe2+浓度的变化。（文献参考PMID：39778769）
· ③关键分子GPX4检测
图6. 使用谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）比色法测试盒（E-BC-K883-M）检测5-FU和Erastin处理的HaCat细胞中GPX-4特异性活性水平。（文献参考PMCID: PMC11902211）
（4）四、铁死亡研究相关试剂推荐
Glutathione Peroxidase 4 (GPX4) Activity Assay Kit
Total Glutathione (T-GSH)/Oxidized Glutathione (GSSG) Colorimetric Assay Kit
Glutathione Peroxidase (GSH-Px) Activity Assay Kit
Ferroptosis Suppressor Protein-1 (FSP-1) Inhibitor Screening Kit
ACSL4 Polyclonal Antibody
4-HNE(4-Hydroxynonenal) ELISA Kit
Lipid Peroxide (LPO) Fluorometric Assay Kit
Lipid Peroxide (LPO) Colorimetric Assay Kit
Reactive Oxygen Species (ROS) Fluorometric Assay Kit (Green)
MDA(Malondialdehyde) ELISA Kit
Malondialdehyde (MDA) Colorimetric Assay Kit (TBA Method)
Malondialdehyde (MDA) Colorimetric Assay Kit (Cell Samples)
Human FE(Ferritin) ELISA Kit
Mouse TF(Transferrin) ELISA Kit
Total Iron Binding Capacity (TIBC) Colorimetric Assay Kit
Cell Ferrous Iron (Fe2+ ) Fluorometric Assay Kit
MitoBright Green Probe Assay Kit
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (with JC-1)
Caspase 3/7 Activity Detection Substrate for Flow Cytometry
Caspase 1 Activity Detection Substrate for Flow Cytometry
Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity Assay Kit (WST-8 method)
Recombinant GSDMD Monoclonal Antibody
（5）五、更多模型制备方案参考
细胞铁死亡常用的诱导剂以及体外研究的铁死亡模型推荐以下：
常用的诱导剂：
靶向胱氨酸/谷氨酸反向转运体：Erastin、谷氨酸盐、索拉菲尼、柳氮磺砒啶等，这些都可以抑制System xc- 活性；
靶向GSH：顺铂、荜茇酰胺、丁胱亚磺酰亚胺、DPI2等；
靶向GPX4：RSL3、FIN56、DPI10、六甲蜜胺等；
靶向铁离子和ROS：血红素、青蒿su、BAY87-2243、FINO2等。
常用的抑制剂：
铁螯合剂：去铁胺、Deferasirox、姜黄素、铁调素等；
抗氧化剂：Ferrostain-1、Liproxsrain-1、Trolox、XJB-5-131等；
ACSL4抑制剂：Troglitazone、Rosiglitazone、Pioglitazone等；
氮氧化物：TEMPO、PHOXNO等；
硒补充：硒、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱胺等；
脂氧合酶（LOX）抑制剂：Zileuton、AA861、PD146175、黄芩素等。
人肝癌细胞HepG2、HA22T/VGH 铁死亡模型：RSL3 （0.1-100 μM）处理72 h；
人胶质母细胞瘤细胞U87和U251z铁死亡模型：RSL3（0.25 μM 和 0.5 μM）处理24~48 h；
人结直肠癌细胞 HCT116 和 LoVo铁死亡模型：RSL3（3~10μM） 处理24 h。
（6）参考文献
[1] Pan X , Chen K , Gao W ,et al.Circular RNA circBNC2 inhibits tumorigenesis by modulating ferroptosis and acts as a nanotherapeutic target in prostate cancer[J].Molecular Cancer, 2025, 24(1). DOI:10.1186/s12943-025-02234-9.
[2] Srichairatanakool S .Camellia Tea Saponin Ameliorates 5–Fluorouracil-Induced Damage of HaCaT Cells by Regulating Ferroptosis and Inflammation[J].Nutrients, 2025, 17.DOI:10.3390/nu17050764.
[3] Zhang T , Wang S , Lv J X .Identification of ZIP8-induced ferroptosis as a major type of cell death in monocytes under sepsis conditions[J].redox biology, 2024, 69(February):1-14. DOI:10.1016/j.redox.2023.102985.
[4] Zhou, X., Yang, Y., Qiu, X., Deng, H., Cao, H., Liao, T., Chen, X., Huang, C., Lin, D., & Ni, G. (2025). Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. *Journal of Advanced Research*. Advance online publication. DOI:org/10.1016/j.jare.2025.01.010.
以上就是铁死亡研究从原理、模型到检测的一站式实战攻略。至此，"细胞死亡大侦探"系列推文已全部发布。若您在实验设计、技术细节或Protocol实施中存在疑问，或希望进一步了解相关研究内容，欢迎随时联系我们的技术团队进行交流