正确使用褪黑素ELISA试剂盒需要遵循一系列细致的操作步骤和注意事项，以确保实验结果的准确性和重复性。以下是一个详细的指南：
一、实验前准备
1、试剂平衡：所有液体组分（如标准品、酶标抗体、底物）需提前30分钟恢复至室温，避免冷凝影响反应效率。
2、样本处理：血清/血浆样本需3000 rpm离心6分钟去除颗粒物，避免溶血或脂血；若浓度过高，需用PBS（pH 7.4）稀释后复测。
3、试剂配制：浓缩洗涤液需按说明书比例稀释（如30倍稀释），底物溶液（TMB）需避光保存，若变蓝则失效。
二、实验操作步骤
1、包被：使用0.05M PH 9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
2、加样：将标准品、待测样品（包括空白对照）和阳性对照分别加入相应的反应孔中，37℃孵育1小时。
3、加酶标抗体：每孔加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4、加底物液显色：每孔加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃反应10～30分钟。
5、终止反应：每孔加入2M硫酸0.05ml。
6、结果判定：
肉眼观察：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
ELISA检测仪：在450nm波长（或410nm，如果使用ABTS显色）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
三、注意事项
1、样本处理：不同样本（如血清、血浆、组织匀浆）需按说明处理，避免反复冻融或溶血。
2、试剂储存：未开封试剂应储存在2-8℃，避免阳光直射；开封后密封保存，确保在有效期内使用。
3、操作规范：加样顺序、温育时间、洗涤步骤等必须严格按照说明书执行，避免交叉污染。
4、安全防护：底物B对光敏感且有毒，操作时应佩戴手套和护目镜。
四、建议
1、实验前应预测样本浓度，必要时进行稀释，使其落在试剂盒检测范围内。
2、使用新鲜样本可提高检测准确性。
3、建议设置复孔以提高数据可靠性。
通过遵循上述步骤和注意事项，可以有效地使用褪黑素ELISA试剂盒进行精准检测，并获得可靠的结果。