原代细胞是指从组织或器官中直接分离获得、未经传代培养的细胞。这类细胞在体外培养的早期阶段，仍保留其来源组织的关键生理特性，能够较为真实地反映体内微环境，且遗传和生化特征未发生显著改变。因此，原代细胞是分子生物学和药理学研究的理想模型。以原代皮层神经元细胞为例，科研人员可通过体外培养，系统地研究神经元的生长、分化及功能变化，为神经系统疾病防治提供可靠的实验依据。
值得注意的是，不同类型原代细胞的分离方法存在差异，操作门槛较高。本期细胞学堂，将为您系统介绍大鼠皮层神经元细胞的分离与培养流程，助力您的神经科学研究顺利开展。
一、基本信息
细胞名称：大鼠皮层神经元细胞
组织来源：大脑皮层
细胞简介：皮层神经元细胞是构成中枢神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有突触（轴突）的细胞，由胞体和突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它末端的细小分支叫做神经末梢。胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。
细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一个或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。
形态特征：神经元细胞贴壁后，首先伸出少量突起，随后突起数量逐渐增多，而后进一步延伸并交织成网，同时胞体增大，周边光晕明显。10-12 d细胞形态最为丰满，继续培养神经元开始退化，突起逐渐减少，细胞轮廓模糊，光晕消失，细胞进入凋亡或变性阶段。
二、分离流程
1、解剖操作
选取1-2日龄的Wistar、SD等不同品系大鼠，采用断头法处死后，在无菌条件下迅速取出完整脑组织。
2、组织处理
A. 分离大脑皮层
固定脑组织，用显微弯镊两脚分别沿着“三条黑色实线”所示位置轻轻夹紧，使左右大脑与小脑分离（图1），翻转左右大脑，清除大脑髓质，保留大脑皮层（如图2）。
图1. 分离小脑与大脑
图2. 清除大脑髓质
B. 脑膜去除（二选一）
方案一：翻转左右大脑，暴露脑膜，适当辅助固定，向另一方向拉扯脑膜以撕下（图3），留取纯净皮层组织。
图3. 左手辅助固定脑组织，右手使用解剖镊撕下脑膜
方案二：准备铺有滤纸的培养皿，皮层组织在滤纸上翻滚1-2圈，即可看到红色脑膜从皮层组织上分离开，剩下组织即为纯净皮层组织。
C. 组织剪碎
将去除脑膜后的皮层组织剪碎成1 mm3的小块，重悬于离心管中，离心后弃上清液，收集沉淀。
3、组织消化
向沉淀中加入大鼠皮层神经元细胞专用消化液，消化直至组织块完全分散，随后进行过滤、清洗、重悬，获得单细胞悬液。
4、细胞培养
将细胞沉淀重悬于大鼠皮层神经元细胞完全培养基中，接种于已用铺板工作液包被的T25培养瓶，加入筛选工作液，置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。首次换液在48 h后，以后每2-3天换液一次。
想了解更详细步骤，请查看大鼠皮层神经元细胞分离培养试剂盒说明书。
三、细胞鉴定
1、形态鉴定
细胞贴壁良好，在光学显微镜下可见典型的神经元细胞样，呈多角形或不规则形。
2、标志物鉴定
采用免疫荧光染色，以 β-Tubulin-Ⅲ 为一抗进行染色，通过荧光显微镜观察鉴定结果（图4），细胞纯度可达90%以上。
图4. 大鼠皮层神经元细胞免疫荧光鉴定
四、培养条件
包被条件：多聚-L-赖氨酸溶液（1×）或多聚-L-赖氨酸溶液（10×）稀释成0.1 mg/mL包被
培养基：大鼠皮层神经元细胞完全培养基（含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等）
换液频率：每2-3天换液一次
生长特性：贴壁
细胞形态：神经元细胞样
传代比例：不传代
传代特性：为终末分化细胞，属于不增殖细胞群
消化液：0.125%胰蛋白酶
五、应用方向
皮层神经元细胞因其与人类神经系统的相似性，被广泛应用于神经科学研究，其主要应用方向如下：
01、神经疾病研究
通过体外模拟病理特征，构建神经元损伤模型，如阿尔茨海默病或帕金森病相关特征（β-淀粉样蛋白积累、α-突触核蛋白异常、线粒体功能障碍），用于解析神经退行性疾病的细胞机制。
02、药物筛选与疗效评估
利用皮层神经元病理模型，筛选能够改善神经元存活、促进突触功能或修复神经网络的候选药物，同时评估作用浓度和潜在机制。常用评价指标包括细胞存活率、凋亡标志物、突触密度和电生理活动。
03、神经发育与突触可塑性
观察皮层神经元在体外的发育过程（树突延伸、轴突生长、突触形成与成熟），研究关键基因或蛋白在神经发育及突触可塑性中的作用，可结合形态学分析、分子标志物检测和电生理检测等进行评估。
04、神经毒性评估
利用原代皮层神经元对环境毒素、药物副作用或重金属的高敏感性，可评估外源物质对神经系统的毒性。常用指标包括细胞存活率、凋亡、突触损伤及膜电位变化，为安全性评价提供实验依据。
05、基因功能研究
通过基因过表达、敲低或CRISPR编辑特定基因，观察皮层神经元的形态、功能和存活变化，明确该基因在神经发育、存活及疾病发生中的作用，可结合分子生物学和电生理方法进行验证。
以上是大鼠皮层神经元细胞分离培养的全流程实操分享，详细拆解了关键操作要点与避坑技巧～
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