伊维菌素快速检测试剂盒
（动物组织）使用说明书
【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测动物组织和水产等样本中的伊维菌素，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的伊维菌素和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗伊维菌素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的伊维菌素含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出伊维菌素含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.5 ppb
检测时间： 45min
样本检测下限：
组织……………………………………1.5ppb
交叉反应率
伊维菌素………………………………100%
回收率
组织 ………………………………85±10%
【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3、 酶标记物 7ml………………… 红色帽
4、 抗体工作液 7ml………………… 绿色帽
5、 底物A液 7 ml…………………棕色帽
6、 底物B液 7 ml …………………黑色帽
7、 终止液 7 ml …………………黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液40 ml……………白色帽
9、 2X浓缩复溶液 50 ml ……………蓝色帽
【所用仪器、试剂】
具备的仪器：微孔板酶标仪、氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：单道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
试 剂：乙腈、去离子水、氯化钠
【实验前溶液配制】
配液3、 将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于样本提取后的复溶)。
配液4、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照
1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按
所需用量配制洗涤液。
【样本前处理步骤】
样本处理前须知：处理任何样本时，都必须注意：
（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、
禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。
（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（3）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染，干扰实验结果。
（A）动物组织样本处提取理方法
1、 取3g均质样本至离心管中；加入1g氯化钠和4ml乙腈彻底混合，4000r/min以上离心5min。
2、 转移出2ml上层清亮有机液体，65℃氮气或空气流下完全干燥；
3、 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：1
【酶标免疫分析程序】
1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔,然后加入抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与伊维菌素的含量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243；0.5ppb为1.816；1.5ppb为1.415；4.5ppb为0.74；13.5ppb为0.313；40.5ppb为0.155。则样本1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb; 样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伊维菌素实际浓度。
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以伊维菌素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伊维菌素实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大
量样品的准确、快速分析。
3、标准准曲线：
B/B0 (%)
0.5 1.5 4.5 13.5 40.5
(ppb) [µg/kg]
图1：伊维菌素检测试剂盒的回归曲线
4、再现性：
%CV
0 0.5 1.5 4.5 13.5 40.5
(ppb) [µg/kg]
图2：伊维菌素检测试剂盒的精密度
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出伊维菌素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应伊维菌素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。