中性粒细胞作为机体固有免疫的“先锋部队”，其数量与功能异常常与感染、炎症、自身免疫病等多种疾病密切相关。流式细胞术凭借高灵敏度、多参数分析的优势，成为中性粒细胞鉴定与功能研究的核心工具。但不少科研人在设计方案时会陷入困惑：如何选择特异性标志物？样本该如何处理才能保证细胞活性？仪器参数设置有哪些关键要点？我们将从“样本准备→抗体选择→仪器设置→数据分析→注意事项→常见问题”全流程拆解方案设计要点，帮你避开坑点、高效完成实验！
一、样本准备：新鲜是关键，避免细胞活化/凋亡
中性粒细胞对外界环境敏感，样本处理的核心原则是“快速、温和、避免活化”，不同来源样本的处理方式略有差异：
1. 抗凝处理：使用EDTA或肝素抗凝管采血，避免凝血；
2. 红细胞裂解：采用1×ACK红细胞裂解液温和裂解，避免高渗/低渗损伤细胞；
3. 洗涤离心：1000 rpm离心3-5 min，洗涤2次去除残留裂解液
l 采血后2-4 h内完成处理，避免长时间放置导致细胞活化；
l 红细胞裂解时间不宜过长（通常3-5 min，4℃或冰上裂解）
1. 抗凝后用PBS稀释1-2倍；
2. 过200目筛网去除组织碎片；
3. 红细胞裂解+洗涤离心（同外周血）
1. 机械研磨或胶原酶/透明质酸酶消化（37℃，30-60 min）；
2. 过200目筛网获得单细胞悬液；
3. 离心洗涤后裂解红细胞
l 机械研磨操作需温和，可将组织切成颗粒状后，转移至细胞筛网或尼龙网浸润在PBS缓冲液中研磨，研磨后再次过滤；
l 消化酶浓度需优化，避免过度消化损伤细胞表面标志物，可加入DNase I减少细胞聚集；
l 红细胞裂解避免裂解时间过长影响细胞状态（通常3-5 min，4℃或冰上裂解）
注：详细样本制备流程可登录官网www.elabscience.cn查询技术资源-流式样本技术指南进行获取。
二、抗体选择：精准搭配标志物，避开荧光干扰
中性粒细胞的流式鉴定依赖“特异性标志物+排除性标志物”的组合，同时需兼顾荧光素搭配的合理性，具体实验设计分为两个板块：
1. 核心标志物选择
中性粒细胞的特异性表面标志物：如CD16（FcγRIII）、CD66b、CD11b/CD18（Mac-1）等。其中CD16在成熟中性粒细胞上高表达，在未成熟中性粒细胞（如杆状核）中表达较低。CD66b的特异性最高，几乎仅表达于中性粒细胞。
排除性标志物：常用CD3（排除T细胞）、CD19（排除B细胞）、CD56（排除NK细胞）、CD14（排除单核细胞）、Siglec-8（排除嗜酸性粒细胞）等用于排除淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等杂细胞。
表1. 不同实验目的标志物组合参考
基础表型鉴定，快速、标准地圈定外周血中性粒细胞群。CD66b比CD16更稳定，尤其适用于活化样本。
活化状态检测：CD45/CD16/CD66b/CD11b/CD62L/CD35
活化状态分析,在基础鉴定完成上，加入CD11b（活化后表达上调）、CD62L（活化后表达下调）、CD35（补体受体1，活化后上调）进行活化状态分析。
CD45/CD11b/Ly6G/Ly6C/CXCR2/TGF-β/IL-10
CD45/CD11b/Ly6G/Histone H3/MPO
特殊状态检测，在基础鉴定基础上加入Histone H3和MPO（NETosis特异性标志物）
CD66b/CD16/7-AAD/Caspase-3/7或CD66b/CD16/7-AAD/Annexin V
PE/Cyanine7 Anti-Human CD3 Antibody[OKT-3]
Elab Fluor® Violet 540 Anti-Mouse/Human CD11b Antibody[M1/70]
APC Anti-Human CD14 Antibody[M5E2]
PE Anti-Human CD16 Antibody[3G8]
PE/Cyanine7 Anti-Human CD35 Antibody[E11]
Elab Fluor® Violet 450 Anti-Human CD45 Antibody[HI30]
Elab Fluor® Violet 610 Anti-Human CD62L Antibody[DREG56]
FITC Anti-Human CD66b Antibody[G10F5]
7-AAD Reagent (100 μg/mL)
图1. 人外周血白细胞流式染色实验结果图。使用Elab Fluor® Red 780 Anti-Human CD66b Antibody[G10F5] (E-AB-F1267S)（左）及Elab Fluor® Red 780 Mouse IgM， κ Isotype Control[MM-30] （E-AB-F09782S）（右）对人外周血白细胞进行流式染色
表2. 人外周血粒细胞检测9色Panel参考
PE/Cyanine7 Anti-Human CD3 Antibody[OKT-3]
Elab Fluor® Violet 540 Anti-Mouse/Human CD11b Antibody[M1/70]
APC Anti-Human CD14 Antibody[M5E2]
PE Anti-Human CD16 Antibody[3G8]
PE/Cyanine7 Anti-Human CD35 Antibody[E11]
Elab Fluor® Violet 450 Anti-Human CD45 Antibody[HI30]
Elab Fluor® Violet 610 Anti-Human CD62L Antibody[DREG56]
FITC Anti-Human CD66b Antibody[G10F5]
7-AAD Reagent (100 μg/mL)
2. 荧光素搭配原则
① 高低搭配原则：特异性强表达丰度高的标志物（如CD66b）搭配“亮度低”的荧光素（如FITC），排除性标志物或低表达标志物搭配“亮度高”的荧光素（如PE、APC）；
② 避免荧光素光谱重叠：理想环境下，可选择“非重叠荧光素组合”，如FITC（CD66b）+PE（CD16）+APC（CD14）+PE-Cy7（CD3）；
③ 参考仪器配置：根据实验室流式细胞仪的激光通道选择荧光素（如3激光仪器可覆盖FITC、PE、APC等常见荧光素）。
三、仪器设置：校准为先，精准圈门
仪器设置的核心是“保证信号稳定”和“精准圈定目标细胞群”，具体步骤如下：
1. 仪器校准
实验前用标准微球校准仪器的散射光（FSC、SSC）和荧光通道，确保不同批次实验的信号一致性；同时设置“阈值”，通常以FSC为阈值，排除碎片和噪音信号。
2. 圈门策略
圈门逻辑从“总细胞→有核细胞→粒细胞→中性粒细胞→目标亚群/功能细胞”，逐步缩小范围。
1. 第一步：FSC-A vs SSC-A 圈定总细胞群，排除小碎片；
2. 第二步：FSC-H vs FSC-A 圈定单细胞群，排除细胞聚集体（避免多细胞叠加导致的信号干扰）；
3. 第三步：SSC-A vs CD45 圈定有核细胞（CD45+），排除红细胞、血小板等无核细胞；
4. 第四步：在有核细胞中，根据SSC强度圈定粒细胞群（中性粒细胞属于粒细胞，SSC高表达，区别于SSC低的淋巴细胞和SSC中等的单核细胞）；
5. 第五步：在粒细胞群中，用特异性标志物圈定中性粒细胞（如CD66b+CD16+），同时排除CD14+单核细胞等杂细胞；
6. 第六步：若需分析亚群/活性，在中性粒细胞群中进一步圈定CD16high（成熟）/CD16low（未成熟）或CD11b+（活化）细胞。
四、数据分析：规范设门，合理统计
1. 对照设置：必须设置空白对照（未染色细胞，用于调节自发荧光）、同型对照（与一抗同亚型的无关抗体，用于排除非特异性结合）、单染对照（用于调节荧光补偿，尤其是多色实验）；
2. 结果统计：核心数据包括“中性粒细胞占总细胞的比例”、“中性粒细胞占粒细胞的比例”、“目标亚群（如活化中性粒细胞）占中性粒细胞的比例”，同时可统计平均荧光强度（MFI）反映标志物的表达水平；
3. 软件选择：常用FlowJo、ModFit等软件进行数据分析，设门时需保持一致性，避免不同样本间的设门标准差异导致结果偏差。
五、注意事项：实操关键技巧与避坑指南
1. 样本处理要“快”：中性粒细胞容易活化，从采血/取材到染色完成，尽量控制在2 h内，全程冰上操作（除消化步骤外）可减少活化。
2. 抗体孵育要“准”：严格按照最佳稀释比孵育，孵育时间通常为20-30 min（4℃避光），孵育后用冷PBS洗涤2次，去除未结合的游离抗体。
3. 避免细胞聚集：处理过程中轻柔吹打细胞，避免剧烈震荡。过筛网步骤不可省略，数据分析时严格圈定单细胞群。
4. 多色实验优先优化补偿：荧光补偿是多色流式的关键，若补偿调节不当，会导致标志物阳性率误判，建议用单染管逐一调节各荧光通道的补偿值。
六、常见问题和分析
1. 为什么我的中性粒细胞阳性率很低？
可能原因：① 样本活化导致标志物表达下调；② 抗体浓度过低或孵育时间不足；③ 圈门错误，漏选粒细胞群；④ 组织样本消化过度，细胞表面标志物破坏。建议排查样本处理流程和圈门策略。
2. 如何区分中性粒细胞和嗜酸性粒细胞？
两者均属于粒细胞（SSC高），可通过特异性标志物区分：中性粒细胞CD66b+CD16+，嗜酸性粒细胞Siglec-8+，在方案中加入Siglec-8抗体即可排除嗜酸性粒细胞干扰。
3. 未成熟中性粒细胞的鉴定有什么要点？
未成熟中性粒细胞（如杆状核、早幼粒）CD16表达较低（CD16low），可搭配CD33（表达上调）和CD66b（阳性）进行区分，同时结合SSC强度（未成熟中性粒细胞SSC略低于成熟中性粒细胞）。
总的来说，中性粒细胞流式鉴定方案设计的核心逻辑的就是“精准匹配实验目的、严控样本活性、规范操作流程”。掌握这些要点，就能大幅降低实验返工率，让数据更可靠！
相信很多小伙伴在中性粒细胞流式实验中都有自己的“独家技巧”，或是遇到过棘手的难题——比如特殊样本的处理心得、抗体搭配的避坑经验，都欢迎在评论区留言分享交流。想要获取更多流式实验干货、试剂选择指南、数据解读技巧，记得关注我们