mIHC多色技术在三级淋巴结构TLS研究中的应用分享：
三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures,TLSs）是近来肿瘤免疫治疗的新热点，其产生并存在于肿瘤等慢性炎症部位附近，因而相较于二级淋巴器官、能更高效地抑制相关炎症反应。三级淋巴结构因其直接的位置分布及强大的免疫功能，在肿瘤免疫治疗中被寄予厚望。
三级淋巴结构TLS示意图，图片来源于自网络
本文研究了在G1/G2期非功能性胰腺神经内分泌肿瘤中三级淋巴结构TLS的分布、细胞组成、与肿瘤浸润免疫细胞的相关性以及预后价值。其主要方法就是对取自两个队列的患者肿瘤组织样本进行HE染色、IHC及mIHC染色分析。
研究发现超过1/ 3的G1/G2期非功能性胰腺神经内分泌肿瘤样本中发现了TLS，且位于瘤周、肿瘤组织外沿或间质区。TLS主要由带有生发中心的B细胞滤泡和带有树突状细胞的T细胞区组成。Kaplan-Meier分析显示，TLS的存在与更长的无复发生存期(RFS, p＜0.001)和总生存期(OS, p=0.001)相关，而TLS的数量则没有预后意义。
三级淋巴结构TLS的IHC及组织学情况
如上图所示，研究者首先用常规IHC方法鉴定了TLS中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD20+B细胞、CD11c+DCs、CD45RO+记忆性T细胞、NCR1+的NK细胞、FOXP3+Tregs和CD68+的肿瘤相关巨噬细胞TAMs；进而根据IHC的结果，选择对TLS中作为主要组成的CD45RO+记忆性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD20+B细胞进行mIHC多色共定位，结果如下图所示，深入定量分析可知TLS中占比最多的是39.35%的CD45RO+记忆性T细胞，然后是36.61%的CD20+B细胞、20.05%的CD4+T细胞以及3.99%的CD8+T细胞。
非功能性胰腺神经内分泌肿瘤样本的mIHC多色结果
后续的研究，研究者探讨了TLS存在与否和两组队列样本无复发生存期RFS及总生存期OS的关系，结果如下图所示，TLS显著提升了两组队列RFS和OS值。
Association of the presence of TLS with RFS and OS in the Fudan cohort (A,B) and external validation set (C,D).
本文研究人员认为三级淋巴结构TLS在G1/G2期非功能性胰腺神经内分泌肿瘤组织中表征了一个免疫应答微环境，并且有潜力成为分析RFS和OS的一个独立预后因素。
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