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鼠抗对氨基苯磺酰胺单抗(1D6株);对氨基苯磺酰胺抗体

发布日期:2025/11/10 23:56:47发布人:费雪(杭州)医学研究有限公司
鼠抗对氨基苯磺酰胺单抗(1D6 株)的制备遵循半抗原 - 载体偶联 + 杂交瘤技术路线,交叉反应率集中于结构类似的磺胺类药物,对非磺胺类药物交叉率极低,具体如下:

一、制备流程

1. 抗原设计与合成

  • 半抗原制备:对氨基苯磺酰胺(磺胺类药物母核)无免疫原性,通过化学修饰在氨基或磺酰胺基团引入 6 - 氨基己酸作为间隔臂,保留核心表位(苯环 + 磺酰胺基),合成活性半抗原。

  • 偶联免疫原:采用碳二亚胺法(EDC)将半抗原与载体蛋白(BSA/OVA)偶联,偶联比控制在 15-25:1(半抗原:载体蛋白),制备免疫原(对氨基苯磺酰胺 - BSA)和检测原(对氨基苯磺酰胺 - OVA)。

2. 动物免疫与细胞融合

  • 免疫程序:选取 6-8 周龄 Balb/c 雌性小鼠,首次免疫用 50μg / 只免疫原与弗氏完全佐剂乳化皮下注射;间隔 2-3 周加强免疫 2 次,用弗氏不完全佐剂;末次免疫(腹腔注射,无佐剂)后 3 天取脾细胞。

  • 细胞融合:脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞按 5:1 比例混合,50% PEG 4000 诱导融合,接种至含 HAT 培养基的 96 孔板,37℃、5% CO₂培养 7-10 天。

3. 筛选与克隆化

  • 初筛:间接 ELISA 法以检测原包被,筛选上清液中能结合抗原的阳性杂交瘤细胞。

  • 复筛:间接竞争 ELISA 用对氨基苯磺酰胺标准品进行抑制实验,筛选抑制率高、亲和力强的阳性克隆。

  • 克隆化:采用有限稀释法克隆化 3 次,获得稳定分泌抗体的 1D6 杂交瘤细胞株,验证传代 5 代后抗体分泌稳定性。

4. 抗体生产与纯化

  • 生产方式:体内诱生法(小鼠腹腔接种细胞,收集腹水)或体外无血清培养法(生物反应器收集上清)。

  • 纯化:Protein G 亲和层析纯化,纯度达 90% 以上,抗体类型为 IgG1 亚型,分子量约 150 kDa。


二、交叉反应率分析

1. 核心交叉反应规律

1D6 株抗体识别对氨基苯磺酰胺的核心表位(苯环 + 磺酰胺基),交叉反应仅发生于共享该核心结构的磺胺类药物,非磺胺类药物无明显交叉。

2. 具体交叉率范围(基于同类单抗数据及结构推导)

药物类别代表药物交叉反应率(CR%)
磺胺类(母核一致)
磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑
30%-60%
磺胺类(侧链修饰)
磺胺异恶唑、磺胺二甲嘧啶
10%-25%
磺胺类(结构差异大)
磺胺脒、磺胺噻唑
<5%
非磺胺类药物
青霉素、氟喹诺酮、四环素
<1%
其他芳香族化合物
对氨基苯甲酸、苯磺酸钠
<0.5%

3. 影响交叉率的关键因素

  • 药物结构相似度:侧链取代基越简单(如磺胺嘧啶仅含嘧啶环),与核心表位相似度越高,交叉率越高;侧链复杂或环结构改变(如磺胺噻唑含噻唑环),交叉率显著降低。

  • 检测体系:间接竞争 ELISA 中,优化抗原包被浓度(0.5-2 μg/mL)和抗体稀释度(1:10000-1:50000),可将高交叉率药物的 CR% 降低 10-15%。


三、应用建议

  1. 适用于磺胺类多残留检测(如食品中磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑等联合筛查),交叉反应可覆盖多数常见磺胺类药物,无需单独制备多种抗体。

  2. 若需特异性检测对氨基苯磺酰胺,需通过优化检测条件(如提高竞争药物浓度、使用高特异性包被抗原),或结合样品前处理(如固相萃取富集目标物)减少交叉干扰。

  3. 非磺胺类药物对检测结果无影响,常规检测无需设置此类药物的交叉对照。



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